Anabolik ajanlar sığır, koyun ve diğer evcil hayvanlarda büyümeyi arttıran ve canlı ağırlık artışına neden olan maddelerdir.

1.0. AMAÇ VE KAPSAM
Et ve et ürünlerinde; kompetatif enzim immunassay metodu ile kantitatif olarak 17 β-Östradiol hormonunun belirlenmesi.

2.0. UYGULAMA YÖNTEMLERİ
2.1. Alet Ekipman Tanımları
- 450 nm spektrofotometre
- evaporatrör
- ultra turrax
- RIDA C18 kolon (R- Biopharm AG, R2002)
- 1-20 µl, 50 µl- ,100 µl- , 200 µl- , 500 µl ve 1000 µl lik otomatik pipetler
- Santrifüj edilebilir kapaklı tüpler
- Soğutmalı santrifüj

2.2. Kimyasal Maddeler

- Methanol p.a
- tert.-butylmethylether p.a.
- 20 mM PBS buffer ( pH 7.2-7.5)
- 67 mM PBS buffer ( pH 7.2-7.5)

2.2.1. Kimyasal maddelerin hazırlanması

- Methanol ün % 40’lık ve % 80’lik olmak üzere iki ayrı konsantrasyonu hazırlanır.

- tert.-butylmethylether p.a. direk olarak kullanılır.

- 20 mM PBS buffer ( pH 7.2-7.5):
0.55 g NaH2PO4 x H2O+ 2.85 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl 1000 ml distile suya tamamlanır.


- 67 mM PBS buffer ( pH 7.2-7.5):
1.8 g NaH2PO4 x H2O+ 9.61 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl 1000 ml distile suya tamamlanır.


2.3. Numunenin Hazırlanması:
1. Et örneği parçalanır (parça et ise yağlı kısımları temizlendikten sonra)
2. Bu parçalanmış numuneden 10 g cam bir kap içine alınarak 10 ml 67 mM PBS buffer ile 5 dakika çalkalanarak iyice homojenize edilir.
3. Homojenize edilen bu örnekten 2 g santrifüj tüpüne alınır ve üzerine 5 ml tert.-butylmethylether ilave edilerek 30-60 dak çalkalayıcıda çalkalanır.
4. 10-15°C de 10 dak 3000 g de santrifüj edilir.
5. Süpernatant başka bir santrifüj tüpüne alınır.
6. Ekstraksiyon işlemi tekrar 5 ml tert.-butylmethyether eklenerek tekrarlanır.
7. Eter fazları birleştirilir ve bu birleştirilen eter fazları kuruyuncaya kadar uçurulur.
8. Bu kalıntıya 1 ml % 80’lik methanol ilave edilir ve iyice çalkalanarak çözündürülür.
9. Metanolik solusyona 2 ml 20 mM PBS buffer ilave edilir ve aşağıdaki şekilde RIDA C18 kolondan geçirilir
10. RIDA C 18 kolondan % 100’lük metanolden 3 ml geçirilir,
11. Daha sonra 2 ml 20 mM PBS buffer geçirilir,
12. Bu işlemden sonra 9. maddedeki hazırlanmış olan numune (=3 ml) kolondan sn de 1 damla akacak şekilde geçirilir.
13. Numuneden sonra 2 ml % 40’lık metanol geçirilir.
14. Tüm içeriği kolondan uzaklaştırın ve 3 dak süre ile kolondan basınçla hava geçirin. Bu tüp uzaklaştırılır ve kullanılmaz.
15. Kolonun altına temiz bir tüp yerleştirilir. Kolonun üzerinden 1 ml % 80’lik metanol geçirilir.
16. Bu metanolik süzüntü uçurulur ve kalan kuru kısım 1 ml sample buffer ile tekrar çözündürülür.
17. Bu sıvının 20 ml si test için kullanılır.

2.4. Reaktiflerin Hazırlanması:
· Tüm reaktifler oda ısısına getirilir.
· Kullanımdan sonra reaktifler hemen 2-8°C’ye kaldırılmalıdır.
· Standartlar, substrat, kromojen ve stop solüsyonu kullanıma hazır haldedir.
· 17 β-Östradiol enzim konjugatın hazırlanması:
- Şişesi kırmızı kapaklıdır.
- 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl konjugat konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)
· Anti-17 β-Östradiol antibody hazırlanması:
- Şişesi siyah kapaklıdır.
- 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl antibody konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)

3.0 Testin yapılışı:
- Standartlar kullanıma hazır haldedir. İlk 6 kuyucuğa sırayla standartlardan 20 µl pipetlenir.
- 7. kuyucuktan itibaren hazırlanan numunelerden 20 µl pipetlenir.
- Tüm kuyucukların üzerlerine 50 µl dilüe edilmiş enzim konjugat pipetlenir.
- Tüm kuyucukların üzerine 50 µl dilüe edilmiş anti-17 β-Östradiol antibody ilave edilir.
- Plate hafifçe çalkalanır ve üzeri alimünyum folyo ile kapatılarak 2 saat oda ısısında inkubasyona bırakılır.
- İnkubasyon süresi sonunda kuyucuklar 3 defa distile su ile yıkanır.
- Kuyucuklar ters çevrilerek kurutma kağıdı üzerinde suyu alınır.
- Tüm kuyucukların üzerine 50 µl substrat ve 50 µl kromojen pipetlenir. Hafifçe karıştırılır ve alüminyum folyo ile kapatılarak 30 dakika oda ısısında karanlıkta inkube edilir.
- Bu süre sonunda 100 µl stop solüsyonu pipetlenir.
-
4.0 Hesaplama:

- 450 nm de okutulur.
- Sonuçlar bilgisayara girilerek hesaplanır.
- Yukardaki hazırlanış şekline göre et numunelerinde dilüsyon faktörü 1 dir.