Konu: Anabolizan Madde Tayini (DES hormonu)

Anabolik ajanlar sığır, koyun ve diğer evcil hayvanlarda büyümeyi arttıran ve canlı ağırlık artışına neden olan maddelerdir.

1.0. AMAÇ VE KAPSAM

Et ve et ürünlerinde; kompetatif enzim immunassay metodu ile kantitatif olarak DES hormonunun belirlenmesi amaçlanmıştır.

2.0. UYGULAMA YÖNTEMLERİ

2.1. Alet Ekipman Tanımları

- 450 nm spektrofotometre
- evaporatrör
- ultra turrax
- RIDA C18 kolon (R- Biopharm AG, R2002)
- 1-20 µl, 50 µl- ,100 µl- , 200 µl- , 500 µl ve 1000 µl lik otomatik pipetler
- Santrifüj edilebilir kapaklı tüpler
- Soğutmalı santrifüj

2.2. Kimyasal Maddeler

- Methanol p.a

- tert.-butylmethylether p.a.
- petroleum ether
- 6 M phosphoric acid
- 1 N NaOH
- 20 mM tris-HCl buffer ( pH 8.5)
- 67 mM PBS buffer ( pH 7.2)
- washing buffer: NaH2PO4 x H2O + Na2 HPO4 x 2 H2O + NaCl + Tween 20

2.2.1. Kimyasal maddelerin hazırlanması

- Methanol’ ün % 40’lık, % 70’lik ve % 80’lik olmak üzere üç ayrı konsantrasyonu hazırlanır.
- tert.-butylmethylether p.a. direk olarak kullanılır.
- washing buffer : 20 mM PBS buffer ( pH 7.2)

0.55 g NaH2PO4 x H2O+ 2.85 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl + 1 ml Tween 20
1000 ml distile suya tamamlanır. (bu buffer 2-8 oC’de bir hafta dayanıklıdır)

- 67 mM PBS buffer ( pH 7.2):

1.8 g NaH2PO4 x H2O+ 9.61 g Na2 HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl 1000 ml distile suya tamamlanır.

- 20 mM tris-HCl-buffer, pH 8.5

- methanol/tris-HCl (20/80 v/v): 2.42 g tris-(hydroxymethyl)-aminomethane alıp 700
ml distile suda çözündürün + 200 ml % 100’lük methanol ilave edin, 5 M HCl ile
pH’yı 8.5’e ayarlayın ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlayın.

2.3. Numunenin Hazırlanması:

1. Et örneği parçalanır (parça et ise yağlı kısımları temizlendikten sonra)
2. Bu parçalanmış numuneden 5 g cam bir kap içine alınarak 10 ml 67 mM PBS pH 7.2 ile 5 dakika çalkalanarak iyice homojenize edilir.
3. Homojenize edilen bu örnekten 3 g santrifüj tüpüne alınır ve üzerine 8 ml tert.-butylmethylether ilave edilerek 20 dak iyice çalkalanır.
4. Oda ısısında (20-25 oC) 10 dak 3000 g de santrifüj edilir.
5. Eter süpernatantı başka bir tüpe alınır.
6. Ekstraksiyon işlemi tekrar 8 ml tert.-butylmethyether eklenerek tekrarlanır.
7. Eter fazları birleştirilir ve bu birleştirilen eter fazları kuruyuncaya kadar uçurulur.
8. Kalıntıya 1 ml % 70’lik methanol ilave edilir ve iyice çalkalanarak çözündürülür.
9. Metanolik solusyona 3 ml petroleum ether ilave edilir ve 15 saniye karıştırılarak homojenize edilir.
10. Kısa süre santrifüj edilir ve petroleum ether supernatantı ayrılıp atılır.
11. Metanolik solusyon uçurulur ve kalıntı 1 ml dichlormethane içinde çözündürülür ve 3 ml 1 N NaOH ile ekstrakte edilir.
12. Bu ekstrakt 300 μl 6 M phosphoric acid ile nötralize edilir ve aşağıdaki şekilde RIDA C18 kolondan geçirilir
13. RIDA C 18 kolondan % 100’lük metanolden 3 ml geçirilir,
14. Daha sonra 2 ml methanol/20 mM tris-HCl (20/80 v/v) pH 8.5 geçirilir,
15. Bu işlemden sonra 12. maddedeki hazırlanmış olan numune (yaklaşık 3.5 ml) kolondan sn de 1 damla akacak şekilde geçirilir.
16. Kolondan tekrar 2 ml methanol/20 mM tris-HCl (20/80 v/v) pH 8.5 geçirilir
17. Daha sonra 3 ml % 40’lık metanol geçirilir.
18. Tüm sıvı içerik basınçla kolondan uzaklaştırılır ve 3 dak süre ile kolondan hava geçirilerek kurutulur. Bu tüp uzaklaştırılır ve kullanılmaz.
19. Kolonun altına temiz bir tüp yerleştirilir. Kolonun üzerinden 1 ml % 80’lik metanol geçirilir. Tamamının geçtiğinden emin olun.
20. Bu metanolik süzüntü 1:2 (1+1) oranında % 80’lik metanol ile dilüe edilir.
21. Daha sonra bu solusyon 1:2 (1+1) oranında distile su ile dilüe edilir.
22. Bu sıvının 20 ml si test için kullanılır.

Not: %80’lik veya %40’lık metanol solusyonu içindeki elüeler -20 oC’de birkaç ay, buzdolabında 2 hafta saklanabilir.

2.4. Reaktiflerin Hazırlanması:

· Tüm reaktifler oda ısısına getirilir.
· Kullanımdan sonra reaktifler hemen 2-8°C’ye kaldırılmalıdır.
· Standartlar, substrat, kromojen ve stop solüsyonu kullanıma hazır haldedir.
· DES enzim konjugatın hazırlanması:
- Şişesi kırmızı kapaklıdır.
- 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl konjugat konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)
· Anti-DES antibody hazırlanması:
- Şişesi siyah kapaklıdır.
- 1:11 oranında buffer ile dilue edilir (200 µl antibody konsantre+ 2 ml buffer; 4 strip için yeterlidir)

3.0 Testin yapılışı:

- Standartlar kullanıma hazır haldedir. İlk 6 kuyucuğa sırayla standartlardan 20 µl pipetlenir.
- 7. kuyucuktan itibaren hazırlanan numunelerden 20 µl pipetlenir.
- Tüm kuyucukların üzerine 50 µl dilüe edilmiş anti-DES antibody ilave edilir.
- Hafifçe karıştırılarak bir gece oda ısısında (20-25 oC) inkube edilir.

Not: Test prosedürüne devam etmeden önce kit reaktifleri en az yarım saat süreyle oda ısısına (20-25 oC) getirilmelidir.

- Kuyucuklar 3 defa washing buffer ile yıkanır.
- Tüm kuyucukların üzerlerine 50 µl dilüe edilmiş enzim konjugat pipetlenir. Plate hafifçe çalkalanır ve üzeri alimünyum folyo ile kapatılarak 1 saat oda ısısında (20-25 oC) inkubasyona bırakılır.
- İnkubasyon süresi sonunda kuyucuklar 3 defa washing buffer ile yıkanır.
- Kuyucuklar ters çevrilerek kurutma kağıdı üzerinde suyu alınır.
- Tüm kuyucukların üzerine 50 µl substrat ve 50 µl kromojen pipetlenir. Hafifçe karıştırılır ve alüminyum folyo ile kapatılarak 30 dakika oda ısısında (20-25 oC) karanlıkta inkube edilir.
- Bu süre sonunda 100 µl stop solüsyonu pipetlenir.

4.0 Hesaplama:

- 450 nm de okutulur.
- Sonuçlar bilgisayara girilerek hesaplanır.
- Yukardaki hazırlanış şekline göre et numunelerinde dilüsyon faktörü 4 dür.