T.C.
PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ
MÜHENDİSLİK FAKÜLTESİ
GIDA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ








GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ MİKROORGANİZMALARCA GIDA KATKI MADDELERİ ÜRETİMİ



(Biyoteknoloji 1. Vize Çalışması)









HAZIRLAYAN
…









Nisan, 2006
DENİZLİ






İÇİNDEKİLER


Sayfa
1. GİRİŞ 2
2. GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ MİKROORGANİZMALARCA
GIDA KATKI MADDELERİ ÜRETİMİ 3
2.1. Enzim Üretimi 3
2.2. Starter Kültür Üretimi 6
2.3. Etil Alkol Üretimi 8
2.4. Organik Asit Üretimi 9
2.5. Fermantasyon Mikroorganizmalarının Özelliklerinin Geliştirilmesi 9
3. KAYNAKLAR 11



























1. GİRİŞ


Mikroorganizmalar endüstriyel proseslerde kullanım için özellikle uygun canlılardır. Mikrobiyal çeşitliliğin belirlenmesi ve korunması biyoendüstrinin gelişimine çok önemli katkılarda bulunmakta, çok yönlü yapıları ve yüksek büyüme hızları ile mikroorganizmalar ve genetik olarak değiştirilmiş mikroorganizmalar, yeni endüstrilerin oluşturulması için yüksek bir kullanım potansiyeli taşımaktadırlar. Mikroorganizmaların metabolik ve genetik potansiyellerine ilişkin olarak üretilen bilgiler; endüstriyel ve tıbbi önemi olan enzimlerin üretimi, biyoinsektisitlerin üretimi, gıda üretimi ve saklanması, çevre kirliliğinin önlenmesi, kimyasal olarak üretilemeyen bazı antibiyotikler ve steroid hormonları içeren farmasötiklerin üretimi gibi birçok alanda biyoteknolojik süreçlerin geliştirilmesi ve kullanımını arttırmıştır (Gümüşel, 2001).

Genetik modifikasyon terimi sıklıkla rekombinant DNA (rDNA) teknolojisiyle bitki, hayvan ve mikroorganizma genlerinin modifiye edildişi uygulamaları tanımlamak için kullanılır. Bu ileri moleküler teknoloji, bir organizmadan diğerine etkili ve verimli bir şekilde gen transferine olanak sağlar (Drews, 1993). Bakterilerde genetik materyalin küçük veya büyük bir bölümü bir bakteriden diğerine çeşitli mekanizmalar aracılığı ila aktarılıp, sonunda önemli genetik değişiklikler oluşabilmektedir (Kılıçturgay, Gökırmak, Töre, Göral ve Helvacı, 1992).

Bu araştırmada mikroorganizmaların genetik materyallerinin değiştirilmesiyle istenen gıda katkı maddesi üretimi ve kullanım alanları değerlendirilmiştir.





2. GENETİĞİ DEĞİŞTİRİLMİŞ MİKROORGANİZMALARCA GIDA KATKI MADDELERİ ÜRETİMİ


2.1. Enzim Üretimi

Gıdalarda direkt olarak kullanımına “GRAS” (Generally Recognized As Safe) niteliği verilen ve Recombinant DNA teknolojisiyle üretilmiş ilk enzim rennin (chymosin)’dir. Genel olarak dana şirdeninden elde edilen rennin peynir üretiminde pıhtılaşmayı sağlayan proteolitik bir enzimdir
(Harlander, 1990.). Bu enzim mikrobiyal kaynaklardan elde edilmekle birlikte şirden rennin’inin kalitesi çok daha üstündür. Ancak üretim miktarının düşük oluşu ve gelecekte kaynak dar boğazına girilebileceği dikkate alınarak, dana rennin’ini kodlayan gen Eschericia coli içine klonlanarak enzim üretimi başarılmıştır (Eskin, 1990). Ancak enzimin E.coli tarafından hücre dışına salgılanmaması ve sitoplazmada birikmesi nedeniyle çok yoğun ekstraksiyon işlemleri uygulanmaktadır. Bu nedenle enzimi hücre dışına salgılayabilen bazı maya (Kluyveromyces marxianus var lactis) ve küf (Aspergillus niger var. awamori) türlerine rennin geni kodlanarak enzim üretimi gerçekleştirilmiştir (Harlander, 1989.).

İngiltere’de hücre teknikleri ile Saccharomyces cerevisiae Hansen’da buzağı prorennini ve Escherichia coli Castellani ve Chalmers’den de buzağı prorennini sentezlenmiştir ve E.coli’den sentezlenen ile ilk Cheddar peyniri üretilmiştir. Anon, buzağı mide mukoza hücrelerinden prorennin için mRNA kodunun identifikasyonunun ilk basamağı oluşturduğunu ve bu mRNA’nın renninin prokürsörü olduğunu belirtmiştir. Bu mRNA’dan sentezlenen komplemanter DNA’nın bir plasmide eklenip, uygun bir küf veya bakteri içine aktarılmasıyla prorennin üretiminin sağlanacağı açıklanmıştır. Bu prorenninin asidik pH ile de aktif rennine dönüşümünün sağlayacağı bildirilmiştir.

Collaborative Research Inc.’de cDNA’dan prorennin geni yapılmış ve bu genin E.coli içinde ifade edilmesi sağlanmıştır. Goff ve ark. , prorennin genini mayanın promotor geni ile birlikte plasmide eklemişler ve bu rekombinant plasmidi S.cerevisiae’a transfer etmişlerdir. Bunun sonucunda S.cerevisiae’nın total proteinin %0.5’i oranında intrasellüler olarak prorennin ürettiğini ve enzimin çoğunun eriyebilir formda olduğunu gözlemlemişlerdir. Mellor ve ark. , S.cerevisiae ile daha önce çalışmışlardır ve metiyonin-prorennin sekuensinin diğer rennin sekuenslerine göre daha kuvvetli ifade edildiği ve üretilen renninin total proteinin %5’ini oluşturduğunu kanıtlamışlardır. Celltech Inc.’de çalışan araştırmacılar, prorennin geni ile birleşmede “trp” (tryptofan) promotoru kullanmışlar ve total proteinin %5’i üzerinde ürün almışlardır. Aynı şekilde, Emtage ve ark. ile Moir ve ark. da prorennin genini trp promotoru ile birlikte plasmide eklemişler ve sonra bunu E.coli içinde klonlamışlardır. Nishimori ve ark. ise, prorennin genini lac UV5 promotoruna bağlamışlar ve kullandıkları ifade vektörü E.coli’nin pBR322 plasmidinden elde etmişlerdir. Maat ve ark. , E.coli hücrelerinin modifiye edilmiş plasmidleri ile preprorennin ürettiklerini ve periplazmik boşluklarında preprorennin içerdiklerini bildirmişlerdir. Beppu ve ark. , E.coli modifiye plasmidlerini Bacillus Subtilis’e aktararak çalışmalarını genişletmişlerdir. Nagarajan ve ark. , Bacillus amyloliquefaciens fukumoto’e aktarılan plasmidin prorenninin ifadesini ve salgılamasını kontrol eden regülatör ve promotor bölgelerini de içerdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca B.subtilis’den salgılanan enzimin E.coli’den salgılanan enzime göre doğal forma daha yakın bir konfigürasyona sahip olduğu açıklamıştır (Ekmekçi, 1991).

Mikrobiyal rennin üretiminde bu son denemelerden biri de, rekombinant DNA teknikleriyle maya hücresine rennin geninin klonlanması ve böylece yüksek kalitede saf rennin üretiminin mikrobiyal fermentasyonla sağlanmasıdır. Bu tekniğin yakın gelecekte üretiminde kullanılacağı belirtilmiştir (Henriksen ve ark., 1999).

Endüstriyel enzim üretiminde, Rekombinant DNA teknolojisi ile enzimin substrat (katalizlediği kimyasal reaksiyonda ürüne dönüştürdüğü bileşik) seçiciliğinin, aktivitesinin ve stabilitesinin hangi tür amino asit değişiklikleri ile gerçekleşebileceği belirlenir. Bir sonraki aşamada bölge hedefli mutasyon teknikleriyle DNA üzerinde gerekli mutasyonlar oluşturulur. Değiştirilen moleküller konakçı hücrelere aktarılır, hücrelerde ürüne dönüştürülür, daha sonra konakçıdan izole edilerek saflaştırılır ve substrat özgüllüğü, kinetik özellikler, stabilitesi vb. analiz edilerek istenilen özellikleri taşıyıp taşımadıkları belirlenir (Curic, 1998) Rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen ilk enzim, peynir yapımında kullanılan kimozin isimli enzimdir. Peynir üretiminde kullanılan kimozin buzağıların şirdeninden elde edilmektedir. 1984-1985 yıllan arasında Danimarka'da Chr. Hansen A/S Bio Ingredients şirketi, laboratuvarlarında bu enzimi kodlayan genleri, dana midesinden izole ederek genetik modifikasyon ile Kluyveromyces lactis’e ve Aspergillus spp. cinsi küflere aktarmışlar ve bu mikroorganizmalar kullanılarak fermentasyon tanklarında kimozin üretimi gerçekleştirmişlerdir. 1993 yılına kadar, farklı rekombinant mikroorganizmalar (maya, küf ve bakteriler) tarafından üretilen kimozinin gıda endüstrisinde kullanılması toplam 17 ülkede onaylanmıştır (Henriksen ve ark., 1999).

Kluyveromyces lactis mayasından gen teknolojisi ile elde edilen Maxiren ticari isimli kimozin ile Standart rennin enzimi kullanılarak kaşar peyniri imal edilmiştir. Bu enzimim üç aylık olgunlaşma süresince peynir bileşiminde meydana getirdiği değişimlerin saptanarak Maxiren’in Standart rennin enzimi yerine kullanılıp kullanılmayacağı belirlenmiştir. Yapılan analizler sonucunda gerek peynir yapısında; pH, asitlik, kurumadde, kurumaddede tuz, kurumaddede yağ, toplam azot, kurumaddede azot, suda çözünür azot, tirosin, serbest yağ asidi, olgunlaşma indeksi ve peynir randımanı açısından, gerekse peynirlerin duyusal değerlendirmesinde; dış görünüş,iç görünüş, yapı, tat, koku ve sertlik indeksi açısından Maxiren ve Standart rennin enzimi kullanımının birbirine benzer sonuçlar verdiği saptanmıştır. Benzer sonuçlar açığa çıkan peynir suyu bileşimi ve % firenin saptanmasında elde edilmiştir. Bu sonuçlar yapılan istatistiki değerlendirme ile doğrulanmıştır. Sonuç olarak bu çalışma ile, bundan sonra kaşar peyniri yapımında Standart rennin enzimi yerine Maxiren’in kullanılabileceği ortaya konulmuştur. Bunun için kaşar peyniri imalat teknolojisinde ise herhangi bir değişikliğe gerek duyulmamaktadır. Bu önemli bir sonuçtur. Çünkü bundan böyle süt emme çağındaki buzağıların kesimine gerek kalmayacak ve artan peynir ihtiyacını karşılamada yeterli düzeyde rennin enzimi mevcut olacaktır (Üçüncü, 1994).

Gıda ürünlerinde kullanılmak üzere FDA’ye GRAS konumu verilmesi için yapılan ilk başvuru alfa-amilaz enzimi için olmuştur (Lawrence, 1987). Nişasta şurubu üretiminde çok önemli olan bu enzimi kodlayan gen Bacillus stearothermophilus’tan izole edilerek plazmid vektör vasıtasıyla Bacillus subtilis içine yerleştirilmiştir. Recombinant DNA teknolojisinin kullanımı ile yüksek sıcaklığa ve asidik koşullara dayanıklı alfa-amilaz üretimi başarılmıştır. Benzer şekilde nişasta şurupları üretiminde kullanılan pullulanaz enzimine de ısısal dayanıklılık kazandırmak amacıyla yine recombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak, B. subtilis’in pullulanaz enzimini kodlayan geni E. coli içine yerleştirilmiştir (Eskin, 1990).

2.2. Starter Kültür Üretimi

Fermente süt ve et ürünlerinin (peynir, tereyağı, yoğurt, sucuk vb.) yapımında kullanılan starter kültürler, fermente olacak ham besinde istenilen metabolik aktivitenin gerçekleşmesini sağlarlar. Bu kültürler, ürettikleri metabolitler aracılığı ile fermente besinin olgunlaşmasını sağlar ve ona özel bir tat ve koku verirler. Günümüzde gen teknolojileri, bu tip mikroorganizmaların genetik yapılarının değiştirilmesi ve teknolojik ve hijyenik uygunluklarının arttırılması ile tüketiciye ve topluma daha sağlıklı, daha lezzetli, daha ucuz ve daha yüksek kaliteli gıda ürünlerinin sunulması için kullanılmaktadır (Holzapfel ve ark. ,1995) Peynir yapımında kullanılan mikroorganizmaların sahip oldukları amino peptidaz enzimleri, süt proteini kazeini daha küçük yapı taşlarına (küçük peptidler ve amino asitler) parçalamakta, ortaya çıkan yapı taşları ise peynire tat ve kokusunu veren bileşiklerin yapımı için öncülük etmektedirler. Ancak bu enzimin oluşturduğu bazı peptidler acı bir lezzete sahiptir ve peynirin kalitesini düşürmektedir. Araştırmacılar, kazeini farklı bölgelerden kıran, dolayısıyla farklı peptidler oluşturan 4 farklı aminopeptidaz enzimine (aminopeptidaz, dipeptidaz, sistein aminopeptidaz ve endopeptidaz) karşılık gelen genleri ayrı ayrı klonlamışlar ve bu genlerin ürünü olan enzimlerle peynir yaparak, farklı enzimleri taşıyan starterlerle hazırlanan peynirleri, rekombinant olmayan orijinal kültür de kontrolü teşkil etmek üzere belli aralıklarla birçok parametre için karşılaştırmışlardır. İki aylık bir olgunlaştırmadan sonra peynirler arasında önemli bir fark bulunamamış, ancak 4. aydan itibaren aminopeptidaz ve sistein aminopeptidaz gen aktarılmış kültürlerle hazırlanan peynirlerin acılığında önemli bir düşüş belirlemişlerdir. Böylelikle, bu enzimlerin gen teknolojisi kullanılarak organizmaya aktarılmasının ardından peynirin organoleptik özelliklerinin iyileştiği belirlenmiştir. Aminopeptidazlarla ilgili bir diğer sorun da bu enzimlerin hücre içi enzimler olması, kazeinin de hücre içine alınamadığından ancak hücre ölümü ve parçalanması (otoliziz) gerçekleştikten sonra bu enzimlerin peynire geçip kazeini parçalamalarıdır. Araştırıcılar, bu sorunu gidermek için bakteri viruslarının (fajların) bakteri hücreleri içerisinde çoğaldıktan sonra konakçı hücrelerin duvarını yıkarak onları parçalama yeteneğinden yararlanmışlar, bunun için bir önceki aşamada elde ettikleri rekombinant organizmalara ayrıca fajdan izole ettikleri lizin adı verilen proteine ait geni klonlamışlardır. Sonuçta, elde edilen rekombinantın daha çabuk otolize olduğu ve bu organizma ile elde edilen peynirlerin lezzet açısından iyi olduğu panelistler tarafından değerlendirilmiştir (Niven ve ark.,1995; Kilcawley ve ark., 1998; Curic ve ark.,1999; Fred ve ark., 2001)
Tereyağına karakteristik tat ve kokusunu veren, laktik asit bakterilerinin çoğalması ve laktik asit üreterek asiditeyi arttırması sürecinde oluşan diasetil isimli bileşiktir. Starter olarak laktik asit bakterilerinin yanısıra Leuconostoc spp. kullanılarak tereyağında istenmeyen bir bileşik olan asetaldehidi parçalayan bakteri türleri kullanılmaktadır. Ancak bu organizma diasetili indirgeyip kokusuz bileşikler olan asetoin ve bütandiyole dönüştürmekte, böylece de stoktaki tereyağı zaman içerisinde tüm koku ve lezzetini kaybetmektedir. Bu sorunu çözmek için, fvML3 lisin geni aktarılmış Leuconostoc spp.’lerin diasetili indirgeme gücü azalmış mutantları elde edimliş diğer yandan da laktik asit bakterileri genetik manipülasyona tabi tutularak daha fazla diasetil üretmeleri sağlanmıştır (Law ve Haandrikmann, 1997).

2.3. Etil Alkol Üretimi

Etil alkol, bira, şarap gibi alkollü içkilerde bulunan, kimya sanayinde kullanılan, farmasötikler ve temizlik malzemelerine katılan bir kimyasaldır. Etil alkol, çeşitli mikroorganizmaların şekerleri fermente ederek oluşturdukları önemli bir üründür. Saccharomyces cerevisiae 5 günlük bir fermentasyonla % 10-12 düzeyinde etil alkol üretir, daha sonra bu seviyede alkol, üretici hücrelere toksik olduğundan hücre çoğalması durur ve fermentasyon sona erer. Ancak selülozik yapıdaki bitkilerden etil alkol üretilmesi oldukça zordur bunun sebebi ise maya hücrelerinin selülozu parçalayamamasıdır. Selülozu parçalayabilen, etanol üreten, oksijensiz ortamda ve yüksek sıcaklıkta üreyen bir bakteri türü olan Zymomonas mobilis bu anlamda Saccharomyces cerevisiae’ye alternatif bir üreticidir. Ancak bu bakteri etil alkolün yanısıra çeşitli organik asitler de ürettiklerinden etanol verimi düşük olmaktadır. Gen teknolojileri kullanılarak sözü edilen bakterinin istenmeyen son ürünlerine giden metabolik yolları kapatılmış ve etil alkol, modifikasyona uğratılmış bu bakteri tarafından üretilmeye başlanmıştır (Buchholz ve Eveleigh ,1990; Lynd ve ark., 1991).


2.4. Organik Asit Üretimi

Organik asitler sanayide geniş çapta kullanılmaktadır. Asetik, laktik, glukonik ve süksinik asit gibi organik asitler mikrobiyal fermentasyonla üretilmektedir. Bunlardan asetik asit fermentasyonu; Corynebacterium spp. türlerinde bulunan ve biyosentez yolunda önemli olan enzimin genleri, Erwinia herbicola isimli üretici organizmada klonlanmış, gen dozu etkisi ile asetik asit veriminde % 100'ün üzerinde artış elde edilmiştir ( Anderson ve ark., 1985).

2.5. Fermantasyon Mikroorganizmalarının Özelliklerinin Geliştirilmesi

Mikroorganizmalar turşu, şarap, bira, sosis, peynir ve ekmek gibi femante gıdaların üretiminde uzun yıllardır kullanılmaktadır. Genetik mühendisliği ise mikrobiyal starter kültürlerin özelliklerinin daha iyileştirilmesi için kullanılabilmektedir. Süt işleme sanayiinde starter kültürlerin canlılığı ve laktozu fermente edebilirliği uzun yıllardır bir sorun olmuştur. Ancak starter kültür genetiğinin daha iyi anlaşılmasıyla bu soruna çözümler üretilmiştir. Örneğin Streptococcus lactis’in laktoz metabolizmasını kodlayan genin bir plazmidde taşındığı ve bu plazmidi kaybeden hücrenin aynı zamanda laktozu fermente edebilme yeteneğini kaybettiği bulunmuştur. Ancak plazmiddeki gen Streptococcus lactis’in stabil kromozomlarına yerleştirilerek laktoz kullanımı dayanıklı yapılabilmiştir.

Bira fermantasyon teknolojisinde kullanılan mayanın en önemli özelliği nişastayı kullanabilmesidir. Saccharomyces diastaticus mayası nişasta ve deskstrinleri ürettiği alfa 1,4-amiloglukozidaz enzimi vasıtasıyla fermente edebildiği için özellikle düşük kalorili bira üretiminde önemlidir. Ancak bu organizmanın tek dezavantajı birada oluşturduğu kötü lezzet olması nedeniyle, amiloglukozidaz enzimini kodlayan genlerin diğer bira mayalarının içine klonlanması üzerine çalışmalar devam etmektedir. Bira sanayiinde diğer bir problem, kullanılan mayanın proseste kullanılan bakır kaplardan gelen bakır iyonlarına duyarlı oluşudur. Bu nedenle bakır iyonlarına karşı dayanıklılık sağlayan gen geliştirilmiş ve mayaya yerleştirilmiştir. Bira fermantasyonunda kullanılan mayaların özelliklerinin geliştirilmesinde devam eden araştırmalar amilopektinin alfa 1.6 bağlarını parçalayan enzimlerin ve beta-glukonaz enzimlerinin sentezlenebilirliği üzerinedir (Eskin, 1990).



























3. KAYNAKLAR


Gümüşel, F. 2001. Biyoteknoloji, Genetik ve Sağlık Sektörü. Gebze İleri Teknoloji Enstitüsü. Kocaeli.

Boyacıoğlu, D. 1994. Geçmişte ve Günümüzde Gıda Biyoteknolojisi Uygulamaları. İkinci Gıda Mühendisliği Kongresi. Gaziantep.

Kılıçturgay, K. , Gökırmak, F. , Töre, O. , Göral, G. ve Helvacı, S. 1992. Temel Mikrobiyoloji ve Parazitoloji

Küplülü, Ö. , Gücükoğlu, A. 2002. Genetik Modifiye Organizmalar.

Ekmekçi, S. , Kurtuluş, A. 1991. Fermantasyon Yoluyla Fungal Rennin Üretimi. Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. İzmir.

Üçüncü, M. , Balcı, C. 1994. Kluyveromyces lactis’ten Gen Teknolojisi ile Elde Edilen Maxiren Ticari Adlı Kimozinin Kaşar Peyniri Üretiminde Kullanımı Üzerine Araştırmalar. Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. İzmir.