HİBRİDİZASYON




İÇİNDEKİLER


Sayfa
İÇİNDEKİLER I
ŞEKİLLER DİZİNİ II
1. NÜKLEİK ASİT DİZELERİNİN
GÖSTERİLMESİ VE YERLERİNİN BELİRLENMESİ 3
2. HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ 4
2.1. Hibridizasyon Yöntemlerine Giriş 4
2.2. Southern Blot Hibridizasyonu 5
2.3. Northern Blot Hibridizasyonu 10
2.4. İn Sitü Hibridizasyonu 14
2.5. Dot Blot Hibridizasyonu 16
2.6. Koloni Hibridizasyonu 17
2.7. Solusyon Hibridizasyonu 18
2.8. Hibridizasyon Yöntemlerinin Kullanım Alanları 19
3. KAYNAKLAR 20
















ŞEKİLLER DİZİNİ


Sayfa
Şekil 1.1. Southern Blot Hibridizasyonunun Aşamaları (1) 3
Şekil 1.2. Southern Blot Hibridizasyonunun Aşamaları (2) (Devam) 4
Şekil 1.3. Southern Blot Hibridizasyonunun 3 Boyutlu Gösterimi 7
Şekil 2.1. Northern Blot Hibridizasyonunun Şematik Gösterimi 9
Şekil 3.1. İn Sitü Hibridizasyonu Şeması 14
Şekil 4.1. Dot Blot Hibridizasyonu Şeması 15
Şekil 5.1. Koloni Hibridizasyonu Şeması 16























1. NÜKLEİK ASİT DİZELERİNİN GÖSTERİLMESİ VE YERLERİNİN BELİRLENMESİ


Biyoteknoloji ve genetik bilimleri günümüzde gıda, tıp, madencilik, çevre gibi pek çok alanda kullanılır ve ihtiyaç duyulur duruma gelmiştir. Şüphesiz Biyoteknoloji biliminin içinde rekombinant DNA’nın ve gen klonlamasının önemi çok büyüktür. Bu kadar revaçta ve kullanımda olan gen klonlamasında önemli olan aşamalar, gen taşıyan DNA’nın (veya RNA) saf olarak elde edilmesi, genin yerinin belirlenmesi, genin çıkarılması, Taşıyıcı (vektör) DNA’nın elde edilmesi, gen DNA’sının vektör DNA’sı ile birleştirilmesi, Oluşan rekombinant vektör DNA’nın alıcı hücreye aktarılması, seleksiyon, gen ürününün kontrol edilmesi diye sıralanabilir.

Tabi seçici aktarımlar için ihtiyaç duyulan gen parçasının kesilmesine, hatta daha önce bu gen bölgesinin yerinin belirlenmesine ihtiyaç vardır. İşte bu noktada in vitro sentez yöntemi ile birlikte hibridizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemler ile gen sekanslarının yeri belirlenebilir. Ayrıca hibridizasyon yöntemlerinin in vitro sentezden farkı, onun kadar zahmetli ve masraflı olmamasıdır.
















2.HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ


2.1.Hibridizasyon Yöntemlerine Giriş

Blotlama metodu protein ve nükleik asitlerin belirlenmesi amacı ile sıklıkla kullanılan birçok farklı metodun genel ismidir. Ayrıca bu metotlar son yıllarda hibridizasyon veya prob teknolojileri ile paralel olarak kullanılmaktadır. Blotlama elektriksel ortamda jel üzerine göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan protein veya nükleik asitlerin bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmelerini ifade etmektedir. (Bulut ve Doymaz)

Bu metotlardan ilk geliştirileni DNA’nın tespitinde kullanılan Southern Blotlama’dır (1975’te). İlk birkaç yıl jel transferi olarak isimlendirilen bu metot, diğerlerinin de bulunması ile birlikte metodu geliştiren E.M. Southern’e atfen Southern blotlama olarak anılmaya başlamıştır. Daha sonraki yıllarda geliştirilen ve RNA2nın tespitinde kullanılan metot, ilkinin ismine gönderme yapılarak Northern Blotlama olarak isimlendirilmiştir (J.Alwine ve G.Stark tarafından 1979’da). Aynı yaklaşımla en son olarak geliştirilen proteinlerin belirleme metodu Western Blotlama olarak adlandırılmıştır (H.T. Towbin,1979 ve W.N. Burnette, 1981 tarafından). Ayrıca bunlara ek olarak Dot Blot Hibridizasyon ve İn Situ Hibridizasyon da benzer yaklaşımların kullanıldığı diğer blotlama ve hibridizasyon metotlarıdır. (Bulut ve Doymaz)








2.2.Southern Blot Hibridizasyonu
Southern tarafından geliştirildiği için bu adla anılan teknikte, teşhis materyallerinde bulunan mikroorganizmaların izole ve sonra da pürifiye edilmiş DNA’larındaki spesifik sekanslar, işaretli problar (DNA veya RNA prob) yardımı ile ortaya konulur. Bu tekniğin temel aşamaları, kısaca aşağıda gösterilmiştir.







Şekil 1.1.
Southern blot hibridizasyon aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir

(Arda, 2000)



Şekil 1.2.
Southern blot hibridizasyon aşamalarının devamı yandaki şekilde gösterilmektedir.

(Arda, 2000)
1) Genomik DNA’nın izolasyonu: Patolojik materyallerden mikroorganizmalar (bakteri, virüs, parazit vs.) izole edilir, saf olarak üretilir ve bunların DNA’ları ekstre edilerek alınır. Denemelerde, genellikle, saflaştırılmış DNA’lar kullanılır. Mikroorganizmaların DNA’larını elde etmede birçok yöntemler bulunmaktadır. Araştırıcılar kendi becerilerine ve laboratuar olanaklarına göre en uygun olanlardan birini tercih ederek kullanırlar. Eger, bakterilerin DNA’ları kullanılacaksa, önce mikroorganizmaların hücre duvarları ve dış membranlari lize edilir. Bunun için lizozim ve diger enzimlerden yararlanılır. Ayrıca, ekstraksiyon solüsyonuna SDS (sodium dodecyl sulphate), proteinaz K ve RNase’larda katılarak, DNA dışındaki bütün komponentler giderilir. DNA’nın endojenik nukleazlardan korunması için EDTA (bu madde Mg iyonlarını bağlayarak birçok enzimin aktivasyonuna mani olur. Çünkü Mg birçok enzimin aktivasyonu için kofaktördür) katılır. (Arda, 2000)
Ökaryotiklerde, ekstraksiyon tamponlarına fenol veya kloroform da ilave edilerek DNA’nın proteinlerden ayrılması sağlanır. Polisakkaridleri gidermek için de Caesium chloride densite gradient santrifugasyonundan yararlanılır. Plasmid, faj ve virüslere ait genetik materyalin (DNA) elde edilmesinde ve saflaştırılmasında kendilerine ait saptanan özel yöntemler tercih edilir. (Arda, 2000)
2) Spesifik RE ile dijestiyon: Hedef DNA saf olarak elde edildikten sonra, çok az miktarda (0,5 – 5 µg, bu miktar kullanılan hedef DNA’nın türüne göre değişebilir) alınarak ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine, dijestiyonda kullanılacak restriksiyon endonukleaz enziminden, tam bir dijestiyon sağlayabilecek miktarda ilave edilir ve uygun bir süre etkilenmesi sağlanır. Böyle enzimler arasında, EcoRl, Hind III, BamHI, vs. bulunmaktadır. Eğer gerekirse denemede plana uygun olarak iki veya daha fazla enzim de kullanılabilir (restriksiyon analizlerinde). (Arda, 2000)
DNA süspansiyonu ile enzimler uygun ısıda (genellikle, 37°C’ de 4–6 saat kadar) inkubasyona bırakılır. Bu süre içinde enzim, DNA’yı belli bazlardan keserek, küçüklü-büyüklü çok sayıda DNA segmentleri (fragment) meydana getirir. (Arda, 2000)
3) Fragmentlerin elektroforezisi: Dijeste DNA solusyonunu agarose jele (PAGE' de olabilir) uygulanarak uygun bir süre, bazen bir gece 40–50 volt altında elektroforeze tabi tutulur. Bu separasyon sırasında fragmentler büyükten küçüğe dogru bir sıralama ile bantlar oluştururlar. Büyükler başlangıç yerinde, küçük segmentler de karsı uçta lokalize olurlar. Kullanılan cereyanın şiddeti, jelin kalınlığına göre ayarlanır. (Arda, 2000)
Bu aşamada jel üzerinde oluşan bantlar ethidium bromide ile boyanarak U V-ışınları altında görüntülenebilir ve bantlar, standart bantla karsılaştırılarak değerlendirilirler. Eğer başlangıçta iyi bir dijestiyon (kesim) yapılmışsa 20 KB’ dan büyük 100’e yakin bant meydana gelebilir. (Arda, 2000)
DNA’lardaki farklılıkları ortaya koymada, restriksiyon analizleri yapmada, RFLP veya RAPD gibi tekniklerde agarose jel yani sıra PAGE (poliakrilamid jel elektroforezis) de kullanılabilir. (Arda, 2000)
4) Bantların membran üzerine transferi (Southern transfer): Agarose jel (veya PAGE) üzerinde bulunan bantların naylon veya nitroselüloz membran üzerine transferleri yapılır. Bu işlem, elektro transfer, alkali kapillarite veya diğer geliştirilmiş yöntemlerin biriyle kolayca yapılabilir. Nitroselüloz membran yerine, yakin zamanlarda naylon membranlar daha fazla tercih edilmektedirler. Bunun başlıca nedenleri arasında, naylonlar daha sağlam, birim alanda daha fazla DNA adsorbsiyonu sağlamakta, DNA’nın fikzasyonu daha kuvvetli olmakta ve bir membran iyice yıkanıp temizlendikten sonra tekrar kullanılabilmesi olanağı bulunmaktadır. Ayni zamanda, pozitif yüklü olanlar alkaline transferine ve DNA’nın fikzasyonuna da çok uygundurlar ve yüksek sensitivite de sağlarlar. Elektro transfer tekniği ile DNA aktarım işleminin süresi bir geceden, 1–3 saate kadar indirebilir. (Arda, 2000)
5) Denatürasyon ve fikzasyon: Naylon üzerine transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0,5 N NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift iplikçik DNA, bazlar arası bağlar koparak tek iplikçik hale gelir). Bu asamadan sonra naylon membran, 80°C’ ye kadar ısıtılarak, tek iplikçiklerin membran üzerine fikse edilmesi sağlanır. Fikzasyonu sağlamlaştırmak için tespit işlemi vakum içinde yapılır. (Arda, 2000)
Son zamanlarda gerek denatürasyon ve gerekse fikzasyonda daha değişik metotlar da kullanılmakladır.
6) Hibridizasyon: Naylon membran önce, pre hibridizasyon solüsyonu içinde 60–65°C’de 2–4 saat kadar bulundurulduktan sonra yıkanır. Eğer bu ön muamele yapılmazsa, problar tüm membran üzerine bağlanarak filmin tüm siyah görünmesine neden olur. Bu asamadan sonra, membran üzerine işaretli DNA prob (veya RNA prob) ilave edilir. Problar 32p (veya biotinle) işaretli olabilir. Membran üzerine konulan tek iplikçik ve işaretli prob, kendine komplementer olan tek iplikçik hedef DNA segmenti ile non kovalent bağlarla karşılıklı olarak birleşir ve çift iplikçik DNA x DNA dubleksi (eğer RNA prob kullanılırsa DNA x RNA dubleksi) oluşur (hibridizasyon). Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra, membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek iplikçik hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek iplikçik problar giderilir ve böylece membran üzerinde sadece çift iplikçik sekanslar kalmış olur. (Arda, 2000)
7) Otoradyografi: Naylon membran üzerine, X-ısınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR–2) kapatılarak -70°C’ de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin film üzerine etkilemesi sağlanır. (Arda, 2000)
Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde, işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen bulunur ve teşhis konulur.
Eğer Problari işaretlemede biotin kullanılmışsa, avidin, peroksidaz ve kromojen madde yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri gösterir. (Arda 2000)
Yukarıda aşamaları anlatılan Southern blotting tekniğinde de yine iyi yetişmiş teknik elemana, çok fazla ve duyarlı malzemeye ihtiyaç duyulduğu gibi, en önemlisi spesifik etkenin izolasyonuna ve saf olarak üretilmesine gerek vardır. Bu da zaman alan ve klasik yöntemlerle gerçekleştirilen önemli bir ön aşamadır. Ayrıca, kros reaksiyonları önlemek için, problarin çok spesifik olmaları da önemlidir.



Şekil 1.3. Southern Blot için 3 boyutlu bir gösterim.
(Alberts vd,1994)



2.3.Northern Blot Hibridizasyonu

Northern Blot tekniği aynı Southern gibi yapılır. Ancak burada DNA’nın değil RNA’nın içindeki gen parçacıklarının yerinin belirlenmesi amaçlanır.

Başka bir deyişle Northern Blotting RNA'nin jelden bir solid supporta geçisi teknigine verilen isimdir. (Eylül, 2003)

Northern Blot yöntemi çoğunlukla teşhise yönelik amaçlar için değil, genelde araştırma maksadıyla kullanılır. Bu teknik southern blot gibi karmaşık olmasına rağmen kabul edilebilir sonuçlar verir.

Bilinen 3 tip RNA vardır. Bunlar mRNA (mesajcı RNA), rRNA (ribozomal RNA) ve tRNA (transfer RNA)’dır. Northern blot yönteminde izole ve hibride edilen mRNA’dır. (Cornell University site )


















Şekil 2.1. Northern Blot Hibridizasyonu için şematik bir gösterim.
mRNA ekstrakte edilir.

mRNA elektrofarez işlemi için bir jele ilave edilir.1. hat büyüklük standartlarını ( bilinen RNA parçalarının bir karışımı), 2. hat ise RNA’yı bulundurur.

Jelden elektrik geçirilir ve RNA negatif elektrottan hareket ederek uzaklaşır. Hareket ettiği mesafe RNA parçasının uzunluğunu verir. Bu farklılıklar jelde kendini gösterir. Standartlar gidilen mesafenin doğruluğunun kontrolünde etkindir. RNA florasan bir boya ile kirletildikten sonra UV ışık altında görülebilir.

RNA tek sarmal olduğundan daha fazla işleme ihtiyaç duyulmadan jelden transfer edilebilir. Transfer elektriki veya kapilar işlemlerle yüksek tuz solüsyonlarında gerçekleştirilebilir.

RNA için etiketli spesifik prob blot ile birlikte inkübe edilir. Ardından blot yıkanır.


(Cornell University site)
Yıkanan blotlarda görüntüleme yine Southern hibridizasyon yöntemindeki gibi yapılmaktadır.

Ana hatları şekil 2.1’de gösterildiği gibi olan Northern Blot hibridizasyonunun yapım aşamalarının daha iyi anlaşılabilmesi için Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi’nde kullanılan direk bir metot aşağıdadır.

Elektrofarez:
Jel kutusu NaOH ve/veya SDS ile iki saat içinde tutularak yıkanır ve saf su ile durulanır.
Agar jel solüsyonu hazırlanır.
Tamamen eriyene kadar mikrodalgada tutulur.
60–70 °C ‘ye kadar soğutulur, son konsantrasyonu 0,6M olacak şekilde %37 lik formaldehit ilave edilir. Hemen dökülür.
30dk içinde jel sertleştirilir.
Tampon çözelti hazırlanır.(1xMOPS; 0,2M formaldehit)

Örnek hazırlama:
Her sıra için toplam 5–10 mikrogram RNA kullanılır.
RNA’yı H2ODEPC ile 5–10 mikrolitre seviyelerinde eşitle. Biraz yükleme tamponu ilave et.
0,5 mikrolitre EtBr ekle.
5dk 90°C de tut. Sonra buz ile soğut.

Jel üstünde hareket:
8x10 cm 70-100V’ta hareket ettirilir.
BPB jel bitimine yakınlaşana kadar (3–5 saat) hareket devam ettirilir.

RNA’nın Northern yöntemi ile transferi:
Jeli distile su ile 3 kez 5’er dakika yıka.(formaldehiti uzaklaştırmak için)
Jel cetvel ile hizalanır.
Gen ekranı membranı (RNA’ların görüntüleneceği alan) tam jel hizasında kesilir.
Membran birkaç saniyeliğine su ile yıkanır.
Kapilar blot 10 x SSC transfer tamponu kullanılarak hazırlanır.
2 ıslak Whatman – jel – membran – 2 ıslak Whatman – iki kuru Whatman – kâğıt peçete – glasplate – ağırlık
16-24h kâğıt havlular değiştirilerek transfer yapılır.
Çizgiler işaretlenir, membran uzaklaştırılır, 2xSSC’de dikkatlice yıkanır.
Membran ıslak Whatman’ın üstüne konur ve UV ışık uygulanır.(254nm, Stratalinker, Stratagene)
Membran 80 °C’de 1–2 h pişirilir.

Hibridizasyon:
5–10 ml prehibridizasyon tamponu ile 1-4 saat 42 °C’de ön hibridizasyona tabi tutulur.
Radyoaktif işaretlenmiş prob 95 °C’de 3dk pişirilir. Hemen buz ile soğutulur
Prehibridizasyon tamponu atılır ve hibridizasyon tamponu ile probu konarak 42°C’de inkübe edilir.
Membran yıkanır.
Nemli membran -80°C’lik sıcaklığa maruz bırakılır.(Bu işlem sırasında membranın kurumasına mahal verilmemelidir.)

Sökme ve Tekrar Hibridizasyon:
Membran 0,5–3 h 75–85°C’de yıkama solüsyonu ile yıkanır. Burada amaç membranda hiç radyoaktivite kalmamasını sağlamaktır.
Membran artık hava ile kurutulup saklanabilir.
Tekrar hibridizasyon için hibridizasyon protokolü izlenir.
Tamponlar:

10xMOPS:
0,4 M Morpholinopropanesulfonic acid (serbest asit); 0,1 M Na-acetate–3 x H2O; 10 mM EDTA. NaOH ile pH 7,2’ye ayarlanır; soğuk ve karanlıkta bekletilir.
[500 ml: 41,9 g MOPS, 6,8 g NaAc, 10 ml 0,5 M EDTA]

Yükleme Tamponu:
1 x MOPS; 18,5 % Formaldehyde; 50 % Formamide; 4 % Ficoll400; Bromophenolblue. —20°C’de saklanır.
[1 ml: 100 µl 10 x MOPS, 500 µl Formamide, 185 µl Formaldehyde, 40 mg Ficoll400, Bromophenolblue, 215 µl H2O.]

Prehibridizasyon Tamponu:
5 x SSC; 50 % Formamide; 5 x Denhardt-solüsyonu; 1 % SDS; 100 µg/ml sıcaklıkla denatüre edilmiş homolog olmayan DNA. (Salmon spermi DNA veya maya tRNA’sı)
[100 ml: 25 ml 20 x SSC, 50 ml Formamide, 5 ml 100 x Denhardt solüsyonu, 1 g SDS, 1 ml 10 mg/ml DNA.]

Hibridizasyon Tamponu:
Prehybridization tamponu ile birlikte 5 % Dextransulfate (Na-salt, MW 500,000, 50 % stok solüsyonu) ve homolog olmayan DNA olmayacak.
100 x Denhardt solüsyonu:
[500 ml için: 10 g Ficoll 400; 10 g polyvinylpyrrolidone MW 360000; 10 g BSA fraksiyonu; H2O.]
—20 °C’de depolanmalıdır.

20 x SSC:
3 M NaCl; 0,3 M Na-citrate
[1 l: 175,3 g NaCl, 88,2 g NaCitrate]

Yıkama solüsyonu:
5 mM Tris pH 8; 0,2 mM EDTA; 0.05 % Na-pyrophosphate; 0.1 x Denhardt solüsyonu.
[500 ml: 2,5 ml 1 M Tris, 200 µl 0,5 M EDTA, 5 ml 5 % NaPP, 1 ml 50 x Denhardt solüsyonu]
(Fred Hutchinson CRC 2006)

2.4.İn Sitü Hibridizasyonu

1969 yılında ortaya konmasından beri giderek yaygınlaşan in sitü hibridizasyon tekniği, hibridizasyon teknikleri arasında, hücresel ortamda nükleik asit dizelerinin gösterilmesinde kullanılan tek tekniktir.( Başaran, 1999)

Tekniğin ilkeleri oldukça basit olup şu aşamaları içermektedir:

1)Dokuların işlenmesi(Fiske etme ve kesme. Fiksasyon için PBS içindeki %4’lük paraformaldehit kullanılır.)
2)Spesifik olmayan bağlanmaların engellenmesi
3)Hedeflenen nükleik asit dizelerini kılıflarından kurtarmak için hücresel preparatların ön muamelesi.(Denatürasyon)
4)Bir nükleik asit probunun hedeflenen komplementer baz dizisi ile hibridizasyonu(Hibridizasyon)
5)Yıkama.
6)İşaretli probun aranarak hedef nükleik asit dizisinin görüntülenmesi. (Görüntüleme) (Başaran,1999; Bulut, Doymaz)

DNA ve RNA dizilerinin in sitü hibridizasyon tekniği ile gösterilmesi önemli bir araştırma konusu olarak kabul edilmesine karşın klinik uygulamalarda yeni yeni uygulama alanı bulmakta ve giderek yaygınlaşmaktadır. (Başaran, 1999)


Şekil 3.1.
In sitü hibridizasyonun aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir.



(Arda, 2000)

2.5.Dot Blot Hibridizasyonu

Bu yöntemlerde DNA veya RNA örnekleri direk membran üzerine uygulanırlar. Bu uygulama sırasında özellikle çok sayıda örnek taranması mümkün olduğundan, hem çok sayıda örnekten ayni anda sonuç alınır, hem de tasarruf sağlanmış olur. Bu işlem sırasında sıklıkla vakum kullanılmaktadır. Bu işlem aranan nükleik asit dizisinin varlığı ve miktarı hakkında bilgi sahibi olmamızı sağlamaktadır.(Eylül, 2003)

Dot Blot hibridizasyonu DNA veya RNA’nın elektrofarezi yapılmaksızın destek membrana damıtılması ve bu membranda sabitlendikten sonra özgül dizilimlerinin belirlenmesini ifade eder. Hızlı ve basit bir blotlama yaklaşımıdır. Kuru nitroselüloz membrana damıtılan nükleik asitler membranda leke(dot) oluştururlar. Bu lekeler DNA’nın belirli dizilimlerine özgül olan işaretli problar kullanılarak belirlenir. DNA’nın belirlenme ihtimali çalışılan örnekteki DNA miktarına bağlıdır. Bu nedenle fazla miktarda DNA ile çalışılması gerekmektedir.(Bulut, Doymaz)

Dot blot hibridizasyonunu açıklayan bir şema şekil 4.1.’de verilmiştir.

Şekil 4.1.
Dot blot hibridizasyonun aşamaları yandaki şekilde gösterilmektedir.


(Arda, 2000)

2.6. Koloni Hibridizasyonu

Tetrasiklinli ortamda üremeyip te ampisilinli besi yerinde üreyen kolonilerden saf kültür yapıldıktan sonra, kültürden bir agarın yüzeyinde düzgün ve uygun aralıklarla nokta tarzında ekimleri yapılır. Uygun bir isi ve süre inkubasyona bırakıldıktan sonra, kolonilerin iyi gelişmesi sağlanır. Sonra kolonilerin üzerine bir filtre kâğıdı değdirilir ve koloniler simetrik olarak kâğıda geçirilir. Kağıt 0.5 N NaOH ile muamele edilerek, bakterilerin denatürasyonu (iki iplikçikli DNA’nın tek iplikcikli hale dönüştürülmesi) sağlanır. Tek iplikçikler kâğıda fikse edildikten sonra, üzerine radyoaktif (32P) tek iplikçik cDNA veya RNA prob ilave edilir ve bir süre bekletildikten sonra (hibridizasyon için) prob ile komplementer olan bakteri DNA tek iplikçiği birleşir ve çift iplikçikli radyoaktif DNA segmenti oluşur (hibridizasyon). Bundan sonra, üzerine X-ışınlarına duyarlı film kapatarak, radyoaktivitenin filme etkilemesi sağlanır (Otoradyografi). Film üzerindeki radyoaktif bölgeler siyah lekeler halinde görülür. Bu bölgelerde istenilen gen DNA’sı olduğundan, agar üzerinde yeri belirlenir ve koloniler alınarak istenilen gen yönünden incelenirler.(Arda, 2000)
Şekil 5.1.
Koloni hibridizasyon tekniği yandaki şekilde gösterilmektedir.


(Arda, 2000)

2.7. Solüsyon Hibridizasyon Tekniği

Daha az olarak başvurulan bu teknikte, amplifiye edilmiş DNA ürünleri, işaretli problar uygun NaCl yoğunluğuna sahip bir hibridizasyon solüsyonu içinde bir araya getirilirler. Karışım 95°C’de denatüre edilerek, DNA iplikçikleri birbirlerinden ayrılırlar. Solüsyon, 50–60°C’ ye kadar ılıklaştırılarak spesifik problarin sekanslara bağlanması sağlanır. Bu karışım, poliakrilamid jel elektroforezis (PAGE) tabi tutularak separe edilir. Jel içerisinde DNA x DNA hibrid molekülleri büyük olduğundan ve yavaş harekete sahip olacaklarından, başlangıçta yer alırken, küçük moleküller (birleşmemiş problar, tek iplikçik DNA, vs.) daha hızlı hareket ederek karsı uçta lokalize olurlar. Bundan sonraki işlemler aynen Southern blottingde olduğu gibi yürütülür ve değerlendirilir.(Arda, 2000)

2.8. Hibridizasyon Kullanım Alanları

Nükleik asitlerin hücre içi lokalizasyonları, miktar tayinleri, ekspresyonları, regülâsyonları ile değişik bulaşıcı hastalıklar ile kalıtsal hastalıkların belirlenmesinde bazı tekniklerin kullanılması ve geliştirilmesi gerekmektedir.
Nükleik asitlerin belirlenmesi için değişik teknikler kullanılmaktadır. Ancak günümüzde bu işlemler ve bu işlemlerin uygulama alanı bulduğu çeşitli dallar hibridizasyon yöntemlerini tercih etmektedir.

FDA/BAM AOAC, Shigella spp. aranmasında hızlı yöntem olarak DNA hibridizasyon yöntemini önermektedir.(Çakır, 2003)

Bugün, hekimlik alanında, infeksiyöz hastalıkların tanısında, genellikle, klinik belirtiler, patolojik ve histopatolojik bulgular, etkenlerin izolasyon ve identifikasyonları, etkenlere ait antijenik substansların ortaya konulması, immünolojik yöntemler ile teşhise yardımcı olarak hibridizasyon yöntemleri; biyokimyasal, hematolojik, radyolojik yöntemlerin yerine sıkça kullanılmaya başlamıştır.

Kısacası hibridizasyon yöntemleri sadece gen klonlamasındaki gen sekanslarının yerlerinin belirlenmesinde kullanılmakla kalmamış, gelişen teknoloji ve yeni yöntemler ile yaygınlaşarak pek çok alanda kullanıma girmiştir.













3.KAYNAKLAR


Alberts, B. , Bray, D. , Lewis, J. , Raff, M. , Roberts, K. , Watson, J.D. , 1994.
,Molecular Biology of The Cell, Third Edition. , Garland Publishing Inc.

Arda, M. , 2000. Temel Mikrobiyoloji 1, Medisan Yayın Serisi.

Başaran, N. , 1999. Tıbbi Genetik Ders Kitabı (Yenilenmiş ve Genişletilmiş Yedinci
Baskı), Güneş&Nobel Tıp Kitabevi

Bulut, H. Ve Doymaz, M.Z. , Blotlama Teknikleri ve Mikrobiyolojide Kullanımları
http://web.inonu.edu.tr/~iozeol/rdurmaz/UygMolMikr/123.pdf
Son Değiştirilme Tarihi:07.Jul.2002, 07.43

Cornell University Site; http://drylab1.vet.cornell.edu/block4/Reference/Diagnostics/north.html

Çakır, I. , 02.03 DNA Hibridizasyon Yöntemi, 1.Kaynak; Gıda Mikrobiyolojisi ve
Uygulamaları, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü

Eylül, L. , 2003. Pediatrik Moleküler Patoloji and Genetik; Copyleftcopy.

Fred hutchinson Cancer Research Center, 1100 Fairview Ave. N. PO Box 19024
Seattle, WA 98109, ©2006 Fred Hudchinson Cancer Research Center A Non Profit
Organization.