Prof.Dr. Dilek Heperkan
İTÜ, Kimya Metalurji Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü



Özet
Escherichia coli bakterisi 19. yüzyıldan beri bağırsak kaynaklı patojenlerin indikatörü olarak kullanılmaktadır. 1982 yılından sonra E.coli bakterisinin patojenik / toksijenik suşlarının bulunduğu ve ölüme neden olduğu belirlenmiştir. Bu özelliği ve bazı bakterilerin fekal bulaşma/kirlenme ile pozitif korelasyon vermesi; gıda işleme alanında, ortamında çoğalmaması; proseslere dirençli olması; sayım ve tayin yönteminin bulunması ve yöntemin geniş bir uygulama alanına sahip olması gibi özellikler bakımından daha üstün olması, E.coli bakterisinin indikatör olarak öneminin tartışılmasına yol açmıştır. Bu makalede E.coli bakterisi bazı özellikleri bakımından ele alınmış ve indikatör olarak Enterobacter, Enterococcus ve Clostridium perfringens ile karşılaştırılmıştır. Ayrıca su ve gıdalarda E.coli ve koliform test yöntemleri süre açısından incelenmiş, florojenik ve kromojenik maddelerin özellikleri ve besiyerinde kullanımı ayrıntılı olarak ele alınmıştır.



Giriş
Escherichia coli insan, sıcak kanlı hayvanlar ve kuşların normal bağırsak floralarında bulunan bakterilerden birisidir. E.coli taksonomik bakımdan Enterobacteriaceae ailesi içinde yer alır. Bu aile içinde E.coli ile birlikte 30 civarında cins ve pek çok tür bulunmaktadır. Enterobacteriaceae ailesinin üyeleri gıdalarda bozulmaya yol açmak yerine daha çok gıda zehirlenmesine neden olmaları bakımından önemlidirler. E.coli dışındaki diğer önemli Enterobacteriaceae üyelerinden bazıları Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia dır (Madigan ve ark., 1997). Bağırsak florası çevre koşulları, beslenme, ve yaş gibi faktörlere bağlı olarak değişmekle birlikte, Enterobacteriaceae ailesi üyelerinden sadece bir kısmı sağlıklı insanların bağırsaklarında daimi olarak bulunur. Escherichia , Citrobacter, Enterobacter ve Klebsiella koliform olarak isimlendirilmekte olup, bazı özellikleri ile enterik patojenlerden ayrılmaktadır (Batt, 2000). Örneğin fenotipik özellikleri incelendiğinde hepsi gram negatif, sporsuz, çubuk şeklindedir. Fakültatif anaerobik ve çoğu hareketlidir. 35°C sıcaklıkta ve 48 saatlik sürede laktozu fermente ederek asit ve gaz oluştururlar. Koliform organizmaların bir kısmı toprakta ve bitkilerde de yaygın olarak bulunduklarından fekal koliformların ayrılması için besiyeri (EC brot) daha yüksek sıcaklıkta inkübasyona bırakılmalıdır. Sadece kabuklu deniz hayvanları izolatları için 44.5°C, diğer tüm gıdalar için 45.5°C de gaz oluşturanlar fekal koliform olarak kabul edilir (FDA, 1998). Fekal koliform ve koliform kavramlarının taksonomik bakımdan bir değeri olmayıp, sanitasyon göstergesi olarak önem taşırlar ve bu açıdan indeks/indikatör olarak isimlendirilirler. Koliformların varlığı üretimin hijyenik koşullarda yapılmadığını, gıda maddesi, su veya gıda üretim ortamında fekal kirlenmenin bulunduğunu ve Salmonella, Shigella gibi enterik patojen bakterilerin var olabileceğini göstermektedir (indeks organizma). Pastörizasyon gibi ısıl işlem uygulanmış gıdalardaki koliform varlığı ise; işlemin yetersizliğini veya yeniden bulaşma meydana geldiğini ifade etmektedir (indikatör organizma). Fekal kirlenmenin indikatörü olarak, koliformlar içinde, en fazla E.coli kullanılmaktadır. Ancak gıdada E.coli saptanmaması da her zaman enterik patojenlerin bulunmadığını garanti etmemektedir (Smoot ve Pierson, 1997). Avrupa Birliği’nde bazı ülkelerde koliform ve E.coli yerine Enterobacter sayımı tercih edilmekte, özellikle son yıllarda Enterococcus sayımı da kullanılmaktadır. Buna karşılık Amerika Birleşik Devletleri’nde bazı gıdalarda fekal indikatör olarak Clostridium perfringens bakterisinin iyi bir alternatif olabileceği de tartışılmaktadır.



Enterobacter
Enterobacter toprakta, sebze ve meyvelerde, suda yaygın olarak bulunmakta, bağırsakta da koloni oluşturabilmektedir. Enterotoksijenik suşları gıda kaynaklı hastalıklara yol açabilmektedir. Enterobacter özellikle kalorifer böceklerinden sıklıkla izole edilmiş ve bakterinin yayılmasında böceklerin önemli rol oynadığı bildirilmiştir. Gıdayı elle işleyen kişilerin ellerinde bulunma oranının % 25 olduğu, ancak bakterinin ellerde bulunma nedeninin hijyenik değil, bitkisel ürünlerle temastan kaynaklandığı belirtilmektedir (Huber, 2000).



Enterococcus
Genus Streptococcus 16Sribozomal RNA gibi bazı özellikleri dikkate alınarak gruplandırılmış, böylece Enterococcus, Lactoccoccus ve Streptococcus olmak üzere 3 cins ayrılmış, Streptoccoccus faecalis, S.faecium gibi bazı türler Enterococcus altında toplanmıştır (Giraffa, 2000). Enterococcus insan ve hayvanların bağırsaklarında, kuşlarda ve böceklerde, aynı zamanda suda, gıdalarda, üretim ortamında ve ekipmanlarda da bulunur. En önemli özelliklerinden birisi gıdanın üretildiği çevrede, ekipmanlar üzerinde çoğalması ve uzaklaştırılmasının güç olmasıdır. Kurutma, soğuk muhafaza, dondurma ve asitlendirme gibi proseslere karşı koliformların çoğundan daha dirençlidir. Özellikle ısıl işlem görmüş gıdalarda yüksek sayıda bulunması, hammaddelerde de sayısının yüksekliğini, işletme ve ekipmanların sanitasyon koşullarına uygun olmadığını göstermektedir (Shapton ve Shapton, 1994). Sözkonusu nedenlerle yoğurt, tuzlu tereyağı, süt tozu gibi bazı gıdalar ve su için, (suya kolay bulaşıp canlılığını sürdürebildiği için) indikatör olarak Enterococcus türlerinin koliform organizmalardan daha üstün olduğu düşünülmektedir (Giraffa, 2000). Bazı araştırıcılar ise Enterococcus sayımının gıda güvenliği açısından önem taşımadığını, üretim koşullarının yetersizliğini göstermek amacıyla kullanılabileceğini bildirmektedirler (Smoot ve Pierson, 1997). Bakterilerin proseslerdeki davranışlarının farklılık göstermesi nedeniyle prosesten önce ve sonra hedef bakteri olarak farklı organizmalar seçilebilir. Örneğin dondurulmuş ürünlerde, hammaddede koliform varlığı ve sayımı, dondurma işleminden sonra ise Enterococcus sayımı sanitasyon koşullarının değerlendirilmesi açısından daha uygundur.



Clostridium perfringens
Fekal kirlenmenin indikatörü olarak E.coli veya Enterococcus yerine Clostridium perfringens bakterisinin kıymada kullanılabileceği yeni bir görüş olarak literatürde yer almıştır (Obaidat ve Fung, 2005). İndikatör olarak C.perfringens bakterisinin bazı üstünlükleri bulunmaktadır. 40-45ºC gibi yüksek sıcaklıklarda gelişir, generasyon süresi çok kısa olup 7 dakikadır (Ross ve Nichols, 1999). Bağırsakta yaşar ve sayısı yüksektir. Sporlu olduğundan çok çeşitli ortam ve koşullara karşı E.coli bakterisinden daha dirençlidir ve doğal yaygınlık açısından E.coli bakterisinden daha az yaygındır. C.perfringens tayini son derece kolay olup, Fung tarafından geliştirilen çiftli tüp kullanılarak anaerobik koşullara gerek olmadan Tryptose sulfite cycloserine besiyerinde 42ºC de 8-9 saatlik inkübasyon sonunda siyah koloniler halinde sayılabilmektedir (Obaidat Ve Fung, 2005). Bu özellikleri nedeniyle indikatör bakteri için gerekli kriterleri (ICMSF, 2002) diğer bakterilerden daha iyi sağlamaktadır. Ancak C.perfringens’in fekal kirlenmede indikatör bir bakteri olarak yer alabilmesi için kıyma dışında diğer ürünlerde de E.coli ve diğer indikatör bakteriler ile karşılaştırılması ve yasal düzenlemelerin uygun olması gerekmektedir.



E.coli tipleri



E.coli normal bağırsak florası içinde, 106-109 /g miktarında bulunmakta, bağırsaktaki birçok fonksiyonuna ilaveten vitamin sentezi yapmakta, özellikle B ve K vitaminini sentezlemekte, bağırsaktaki varlığı zararsız kabul edilmektedir (Madigan ve ark., 1997; Bettelheim, 1998). Ancak 1982 yılından sonraki çalışmalarda E.coli ‘nin patojenik/toksijenik suşlarının bulunduğu, su ve gıdalar ile alındığında zehirlenmelere, böbrek ve beyinde hasara yol açtığı, hatta ölüme neden olduğu belirlenmiştir (Riley ve ark., 1983). Bakterinin bazı suşları temas yoluyla da bulaşabilmektedir. Patojenik /toksijenik karakterdeki E.coli suşları arasında bazı özellikler bakımından farklılıklar bulunmaktadır. Bu özellikler; bağırsak mükozası ile etkileşimleri, klinik belirtiler, epidemiyolojik ve O:H serolojik gruplardaki farklılıklar olarak sıralanabilir (Hobbs ve Roberts, 1993; Doyle ve ark., 1997). Bu farklılıklar dikkate alındığında 8 tip E.coli bulunmaktadır (Doyle ve ark., 1997; Bettelheim, 1998; FDA, 1998; Donnenberg ve Nataro, 2000) ;
· Enteropatojenik E.coli (EPEC)
· Enteroinvasiv E.coli (EIEC)
· Enterotoksijenik E.coli (ETEC)
· Enteohemorhajik E.coli (EHEC)
· Enteroadherent E.coli (EAEC, bu E.coli tipi bazı kaynaklarda difüz-adhering E.coli, DAEC olarak da geçmektedir)
· Enteroaggregativ E.coli (EaggEC)
· CNF (Citotoxic Necrotising Factor) üreten E.coli
· CLDT (Cytolethal Distending Toxin) üreten E.coli



Tablo 1’de bazı E.coli tiplerinin bulundukları gıdalar ve insan sağlığında meydana getirdikleri istenmeyen değişiklikler gösterilmiştir.



Tablo 1.Bazı E.coli tiplerinin bulundukları gıdalar, zehirlenme belirtileri ve toksin oluşturma özellikleri (Hobbs ve Roberts, 1993; Doyle ve ark., 1997; FDA, 1998; Paton ve Paton, 1998)
E.coli tipi Taşıyıcı Zehirlenmeye neden olduğu gıda Belirtiler Hastalığın adı Toksik özeliği ve organizma sayısı
EPEC(Enteropatojenik E.coli) insan · su· etli börek Bebek ve çocuklarda şiddetli ishalYetişkinlerde şiddetli karın ağrısı(yetişkinlerin çoğu taşıyıcı olup, belirti göstermez) bebek-çocuk ishali Bazı üyeler bir veya birden fazla toksin oluşturabilir
EIEC (Enteroinvasiv E.coli) insan · su· salata· süt· Brie ve camember peynirleri· kümes hayvanlarının etleri üşüme, ateş,karın krampları, dizanteri shigelloza benzer,kalın bağırsak epitel hücrelerinde gelişir, çoğalır ve ülserasyona yol açar, kanlı ishal görülür basilli dizanteri -
ETEC(Enterotoksijenik E.coli) insan · su· hazır yiyecekler· mayonez· Brie peyniri· hindi eti· çiğ sebze ile hazırlanan salatalar şiddetli ishal yolcu ishali gıdada ısıya dayanıklı veısıya dayanıksız toksin oluştururmin. :108 - 1010/g
EHEC(Enteohemorhajik E.coli) sığır · dana kıymadan yapılmış, az pişmiş köfte kıyma (%22)*· kontamine içme suyu · pastörize ve çiğ süt (%2)· salata (%4)· elma suyu (%2) şiddetli karın ağrısı ve kanlı ishal, nadiren kusma,üşüme ateş baş ağrısı · hemorhajik kolit· HUS (HemolitikÜremik Sendrom, böbrek yetmezliği)· TrombotikTrombositope-nik purpura, HUS a benzer ilave olarak beyin hasarı görülür Verotoksinveya Shiga benzer toksinmin.:1-100 /g
*yüzde (%) oranları : bakterinin yol açtığı zehirlenmede o gdanın payını göstermektedir




E.coli tiplerinin tümünde ortak belirti ishaldir. Patojenik E.coli tiplerinde belirtiler gıdanın alınmasından 5-48 saat sonra başlar ve genellikle şiddetli karın ağrısı belirgindir. EIEC ve EHEC de belirtiler daha şiddetli olup, karın ağrısıyla birlikte ishal (diyare) gözlenir ve dışkıda kan görülebilir. Belirtiler yaklaşık 10-24 saat sonra ortaya çıkar (Batt, 2000). E.coli O157:H7 (EHEC), diğer suşlar içerisinde en tehlikeli olandır. E.coli O157:H7 verotoksin üretir, bu toksin Shigella’ nın oluşturduğu toksin ile benzerdir. Kanlı ishale yol açar. E.coli ’ nin toksin oluşturma özelliğine, bakteriofajlar yardımıyla doğrudan veya dolaylı olarak Shigella’ dan transfer edilen genlerin yol açtığı belirtilmektedir (Buchanan ve Doyle, 1997). E.coli O157:H7 Shiga benzeri toksinlerin birini veya her ikisini de üretir. E.coli O157:H7 nin öldürücü özelliğine kısmen, bağırsak mükoza hücrelerine tutunarak verotoksin I ve II oluşturmasının yol açtığı bildirilmektedir (Edwards ve Fung, 2006).




E. coli bakterisinin analiz yöntemleri

Koliform ve E.coli çeşitli nedenlerle gıdalarda aranmaktadır. Bu nedenlerin başında gıda güvenliği gelmektedir. Diğer nedenler ise; standart ve şartnamelere uygunluk, HACCP uygulamaları, araştırma/inceleme amaçlı çalışmalar, doğrulama ve yeterlik testleri olarak özetlenebilir. Özellikle HACCP (Kritik Kontrol Noktaları ve Tehlike Analizleri) sisteminin gıda sanayiinde uygulanma çalışmalarına bağlı olarak hızlı, doğru, güvenilir, ekonomik yöntem ve kitlere gereksinimin artması, tüm dünyada koliform / E.coli analiz yöntemlerinin yoğun araştırmalara konu olmasına yol açmıştır. Test süresinin kısaltılması amacıyla, sıvı ve katı besiyerlerinde mikroorganizma gelişmesi ve metabolik aktivitesine dayalı (gaz oluşumu) klasik yöntemler modifiye edilmektedir. Bu amaç için geliştirilen yöntemlerden birisi florojenik ve kromojenik maddelerin doğrudan izolasyon besi yerine ilave edilmesidir.



Besiyerinde Koliform ve E.coli sayımında Florojenik ve kromojenik maddelerin kullanılması



Florojenik ve kromojenik maddeler doğrudan izolasyon besiyerinde kullanılarak alt kültür besi yeri ve ilave biyokimyasal testler yapılmasına gerek kalmamıştır (Manafi, 1996). Kromojenik maddeler, ortamda bazı bakteriyel enzimler veya metabolitlerle reaksiyona girerek parlak bir renk, florojenik maddeler ise floresan verirler. Florojenik bir madde olan 4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide (MUG) ve kromojenik bir madde olan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-glucuronide (X-GLUC veya BCIG) en fazla kullanılmaktadır (De Boer, 2000). Besiyerlerinde E.coli varlığını göstermek için b-D-glucuronidase (GUD) enziminden yararlanılmaktadır. Bu enzim E.coli suşlarının % 94-96 sında bulunmaktadır (E.coli O157:H7 serotipinde ise bulunmamaktadır). Besiyerinde koliform varlığını göstermek için ise b-galaktozidaz enziminden yararlanılır. Koliformlar b-galaktozidaz enzimine sahiptirler (Townsend ve ark., 1998; De Boer, 2000). MUG lu besiyerinde gelişen bakteri E.coli ise, E.coli’nin içerdiği b- glucuronidase enzimi MUG u parçalar ve 4-methylumbelliferon açığa çıkar. Bu madde besiyeri UV altında 366 nm de incelendiğinde mavi-yeşil floresan verir (Manafi, 1996; De Boer, 2000). Kromojenik besiyerinde E.coli / koliform belirlenmesinde ise organizma koliform ise, kromojenik madde + şeker (galaktoz) kompleksi hücre içinde enzim tarafından parçalanır (koliformlardaki b-galaktozidaz enzimi) ve koliformlar pembe koloniler halinde (şeker parçalanıp, boya maddesi kaldığından) görünür. Test edilen örnekte E.coli varsa kromojenik madde + şeker (glukoz) kompleksi hücre içinde enzim tarafından parçalanır (E.coli deki b- glucuronidase enzimi) ve E.coli mor renkli koloniler halinde görünür. Sonuç olarak kromojenik besiyerinde koliformlar pembe, E.coli ise mor renkli göründüğünden bakteriler birbirinden ayrılır (Anon., 1998; Manafi, 1996; De Boer, 2000).
Kromojenik besiyerinin MUG lu besiyerine göre bazı avantajları bulunmaktadır. Örneğin tipik kolonilerin belirlenmesinde UV lambasına gerek yoktur. MUG lu besiyerinde floresanın tüm agar yüzeyine diffüzyonu farklı kolonilerin saptanmasını güçleştirmektedir. Bu üstünlüklerine rağmen GUD un belirlenmesinde kromojenik besiyeri MUG kadar hassas olmayıp, bazı çiğ gıdaların yapısında da enzimin bulunması (örn. karaciğer) yanlış pozitif sonuçların ortaya çıkmasına yol açmaktadır. Böyle durumlarda floresan madde uzaklaştırıldıktan sonra test yapılması önerilmektedir.



Hızlı yöntemlerle E.coli ve koliform aranması
Tablo 2’de hızlı test kit/ yöntem ve cihazların bazı özellikleri ve süre açısından değerlendirilmesi verilmiştir.



Tablo 2. E.coli / koliform analizlerinde kullanılan hızlı test kit, yöntem ve cihazlara ait bazı özellikler ve test süreleri



Yöntem/test kiti Kullanım amacı Özelliği Test süresi
3M petrifilm E.coli ve koliform sayımı Kuru film, su ile jelleşir(glukuronidaz için indikatör) 24-48 saat
SimPlate E.coli ve toplam koliform MPN seçici besiyeri(E.coli için UV lambası) 24 saat
ColiGel E.coli ve koliform Renk indikatörlü seçici besiyeri (galaktozidaz için indikatör, koliform), UV de floresan (E.coli) 24 saat koliformlar 48saat E.coli
Colilert Suda E.coli ve koliform için var / yok testi Renk indikatörlü seçici besiyeri, E.coli için UV lamba 24 saat
E Colite Suda E.coli ve koliformlar için var / yok testi Renk indikatörlü seçici besiyeri (galaktozidaz için indikatör, koliform), UV de floresan (E.coli) 24 saat
PathoGel Tek bir analizle Koliform; E.coli ve hidrojen sülfür üreten Enterobacteriaceae tayini Renk indikatörlü seçici besiyeri (galaktozidaz için indikatör, koliform) UV de floresan (E.coli)siyahlık (H2S için) 28saat koliform 28saat fekal koliform 48 saat E.coli 48saat H2S oluşumu
toplam koliform/E.colitahmin Renk indikatörlü seçici besiyeri, renk koliform sayısı ile değişir (E.coli için UV lamba) 30 dakika-10 saat
Gene-Trak E.coli Nükleik asit hibridizasyonu 28 saat
Iso-Grid System Direkt koliform ve E.coli sayımı Membran filtrasyon 24 saat
Iso-Grid System Toplam E.coli sayımı veE.coli O157:H7 Membran filtrasyon 24 saat
Reveal Bio-Plate E.coli ve toplam koliform EMS test 24 saat
Impedans yöntemi koliformEnterobacteriaceae sayımı Bakterilerin metabolik faaliyetleri sonucunda metabolizma ürünleri oluşturmaları ve böylece ortamın elektriksel direncini değiştirmeleri 16 saat
E.coli saptanması Antikor-boya kompleksi İlave 6 saat
VIDAS E.coli O157:H7 Otomatik sistem 22-24 saat
Tempo E.coli ve koliform 3lü tüp yöntemi (EMS) esasına dayalı otomatik sistem 22-24 saat
Bax E.coli O157:H7 PCR 8-24 saat



Tablo 2’de görüldüğü gibi E.coli / koliform tayininde süre pek çok yöntemde 22-24 saat dır. E.coli’nin patojen suşlarının ve toksinlerinin belirlenmesinde kullanılan bazı yöntemler ise; enzim imünoesey, polimeraz zincir reaksiyonları (PCR), imunomanyetik seperasyon, antikor-boya konjugat kompleksi, manyetik konsantrasyon/ELISA, imünokromatografi, sandviç ELISA, ters pasif lateks olup test süresi amaca ve uygulanan yönteme göre değişmekle birlikte 7-48 saat dir (Tu ve ark., 2005).



Laboratuarda kullanılacak analiz yönteminin seçiminde laboratuarın teknik özellikleri, testin amacı, test edilecek ürünün özellikleri, teknik personel ve maliyet gibi unsurlar etkili olmaktadır.