Laktazın Trichoderma sp. Tarafından Üretimi

Işıl Seyis ve Nilüfer Aksöz

Hacettepe Üniversitesi,Fen Fakültesi,Biyoloji Bölümü,Beytepe,
TR-06532 Ankara,Türkiye

Alındı:Eylül 22,2003
Gözden Geçirilmiş Tercüme:Şubat 12,2004
Kabul Edilme:Nisan 15,2004


Özet

Alternatif küfsel kaynaklar bulmak için,13 değişik mantar(Aspergillus,Trichoderma,Penicillium,Rhizopu s ve Fusarium sp.) laktaz üretiminde ortalama 30 derecede ve 150 rpm’de 6 gün boyunca yetiştirilmişti.Deneysel sonuçlar gösterdi ki Trichoderma viride ATCC 32098 de maksimum laktaz öz aktivitesi olduğunu bunu da Trichoderma harzianum 1073 D3’ün takip ettiğini gösterdi.Buna ek olarak,süreklilik çalışmaları pH 3.0-7.5 aralığında ve 20 derece ile 70 derece arasında desteklendi.Gözlendi ki pH 3.0-7.5 aralığında ve 20 derece ile 60 derece arasında %90’ın üzerinde,hatta 70 derecede %66 oranında T. Viride ATCC 32098 tarafından üretilen laktazın aktivitesi hesaplandı.Anlaşıldı ki Trichoderma sp.,genellikle T. Viride ATCC 32098,laktazın endüstriyel alanda üretimi için kullanılabilir.
Anahtar kelimler:Laktaz,Trichoderma,pH dengesi,sıcaklık dengesi,küf

Giriş
Bütün canlılar için gerekli bir besin olan süt,laktoz,protein,yağ,vitamin ve kalsiyum-fosfor gibi minealler içerir.Bunların arasında sütteki asıl karbonhidrat ve bir çeşit şeker olan laktoz büyüme sırasındaki temel karbon kaynağıdır.Laktaz (EC 3.2.1.23) laktozu glikoz ve galaktoza hidrolize eder.İnce bağırsaktaki laktaz eksikliğinde,laktoz hidrolize olamaz,ki buna laktoza karşı toleranssızlık denir.(4,5).Bu sebeple,dünya nüfusunun çoğu yüksek miktarda laktoz ihtiva eden gıdaların tüketimi konusunda problemlerle karşı karşıya gelir.Bu sebepten dolayı,laktozu laktazla hidrolize etmek için süt ve süt ürünleri işleme öncesi bu dezavantajı ortadan kaldırmak gereklidir(6).

Diğer taraftan,peynir endüstrisindeki,üretim yoluyla kesilmiş sütün suyu bile,yüksek miktarda laktoz içerdiği halde yeterince yararlanılamamaktadır.Kesilmiş sütün suyunu kullanmak için,laktoz herhangi bir işlemde öncelikli olarak glukoz ve galaktoza parçalanmalıdır.Çevresel görüş noktasında,peynir altı suyunu yoketmektense kullanmak daha iyidir.Sonuç olarak,laktaz çeşitli endüstrilerde birçok işlemler için gereklidir,ve bu nedenle bu enzinimin verimli ve özellikle ekonomik üretimine çalışıldı(6,7).

Laktaz çoğu endüstride birçok uygulama alanı olduğu için birçok araştırmacının dikkatini çekti.Bu enzim bakteri,maya ve küf gibi değişik kaynaklardan elde edilebilir.Ticari enzimler hem Kluyveromyces lactis ve Kluyveromyces fragilis gibi bakteriler ve Aspergillus niger ve Aspergillus oryzae gibi mayalar tarafından üretilir(1,2).Değişik mikroorganizma kaynaklı birçok teknik geliştirilmesine rağmen hala alternatif enzim kaynaklarına ihtiyaç var.Mesela,mandıra endüstrisinde geniş pH ve sıcaklık aralığında sabit laktazlar kullanılabilir.

Bu çalışmada,alternatif küf kaynaklarından laktaz üretimi araştırıldı.İlk önce değişik küfsel kaynaklı laktaz aktiviteleri karşılaştırıldı ve laktaz üretimi için en verimli küf belirlendi.Sonra,üretilen enzimin pH ve sıcaklık sabitliğine çalışıldı.

Malzemeler ve Metodlar

Mikroorganizmalar

Çalışmada,laktaz üretimi için.Marmara Araştırma Merkezi tarafından Türkiye’nin mikroflorasından izole edilen ve sınıflandırılan,Trichoderma harzianum ve Trichoderma viride kullanıldı.Bu küfsel soylar T. Harzianum 1073 D3,T. Harzianum 1567 D2,T. Harzianum 1620 D2,T. Harzianum 1041 D1,T. Viride 1897 A2 and T.viride ATCC 32098.Buna ek olarak Hacettepe Üniversitesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı’ndan,A. niger,Rhizopus,Penicillium sp.,P. Spinulosum,T. Viride,Fusarium culmorum ve F. Accumulatum soyları kullanıldı.Stok kültürleri patates dekstroz agarda 4-5 gün boyunca 4 derecede korunarak üretildi.

Ortam

Ortam Fiedurek ve Ilczuk tarafından büyüme ve enzim üretimi için bazı modifikasyonlar kullanılarak tanımlandı.Ortam içerikleri(g/l cinsinden):laktoz 10.0,pepton 1.5,maya ekstraktı 1.0,KH2PO4 1.0,(NH4)H2PO4 7.0,MgSO4.7H2O 1.0 ve CaCl2 0.3.250 ml’lik erlende 50 ml’lik örnek pH=5’te,121۫ derecede ve 1.52 bar’da 15 dakika otoklavda sterilize edildi.

Aşılama

1 ml’sinde 15*10 üzeri 6 spor içeren spor süspansiyonları pH=5.0’da 50-ml büyüme ortamı içine aşılandı ve 30 derecede ve 150 rpm de 6 gün boyunca inkübe edildi.

Büyümenin belirlenmesi

Kültürlerlerdeki büyüme miktarı filtrasyon metoduyla kuru ağırlık cinsinden hesaplandı.

Enzim aktivitesinin belirlenmesi

Laktaz aktivitesi Reczey et al tarafından tanımlanan metod ile belirlenir.Kültür filtresi 7200 rpm de 15 dakika boyunca santrifuj yapılır ve enzim örneği olarak kullanılır.Enzim 0.1 M sodyum-asetat tamponuyla pH=5’te hazırlanan 2.5 mg/ml o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG) substratı ile analiz edildi.Sonra 1 ml substrat çözeltisi 0.2 ml örnekle 50 derecede 5 dakika inkübe edildi.Reaksiyon,reaksiyon tüpüne %10 sodyum karbonat eklenerek bitirildi.Emilim,Jenway;model 6105 UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak 420 nm ölçüldü.o-nitrophenol’un miktarı standart eğriden hesaplandı.Buna ek olarak,laktoz substrat olarak T. Viride ATCC 32098’de laktaz aktivitesi belirlemek için kullanıldığı zaman,serbest glikoz Trinder Reagent(Sigma) ile hesaplandı.Bir birim laktaz aktivitesi, 50 derecede 1 dakikada 1μmol glikoz veya 1-ml’lik ortamda o-nitrophenol’un ürettiüi enzim miktarı olarak tanımlandı.Özgül aktivite hesaplamaları için,protein miktarı Lowry metoduyla belirlendi(11).

Laktaz dengesi

pH dengesi

Çeşitli pH değerlerindeki enzim dengesi substrat eklenmesinden önce 1 saat oda sıcaklığında kendi tamponlarında(pH=3.0-7.5) enzimi inkübe ederek çalışıldı.Enzim laktaz aktivitesi için standart analiz koşulları altında 50 derecede ve pH=5.0’da analiz edildi.Enzim aktiviteleri bağıl akitiviteler olarak belirlendi.

Isı dengesi

Isı dengesini belirlemek için,laktaz substrat yokluğunda 20 derece ve 70 derece arasında 1 saat süreyle saklandı.Substrat eklendikten sonra,aktivite standart metod tarafından belirlendi(50 derece-pH=5.0).Enzim aktiviteleri bağıl aktivitelerek olarak belirlendi.

Sonuçlar ve Tartışma

Alternatif küf kaynakları bulmak için,verimli ekstraselüler enzimler üreten mikroorganizmalar belirlendi.Bu konuda,30 derecede ve 150 rpm de 6 gün boyunca laktoz üretim ortamında 13 değişik küf(A.niger, T. harzianum 1567 D2, T. harzianum 1073 D3, T. harzianum
1620 D2, T. harzianum 1041 D1, T. viride 1897 A2,
T. viride ATCC 32098, T. viride, Penicillium sp., P. spinulosum,
Rhizopus sp., Fusarium culmorum and F. Accumulatum)yetiştirildi.İnkübasyondan sonra,laktaz aktivitesi,büyüme, ve protein miktarları belirlendi(Fig 1 ve Fig 2).

Literatürde bulunan benzer çalışmalarda,A.niger,Penicillium ve Fusarium sp.’da laktaz üretimi araştırıldı(6,8,12).P. notatum ve P. Chrysogenum ile uygulanan çalışmalarda yüksek enzim aktivitesi araştırıldı ama bizim kullandığımız P. Spinulosum üzerine hiçbir çalışma bulunmadı.Benzer olarak,Fusarium sp. ile çalışmalar araştırıldığı zaman,anlaşıldı ki F. Moniliforme güçlü bir laktaz üreticisiydi ama bizim çalıştığımız F. accumulatum ve F. culmorum üzerinde umut verici sonuçlar bulunmadı.Bu noktada,yukarıda belirtilen çalışmalarda, 1.94–16.23 U/mL arasında laktaz aktivitelerinin değişiklik gösterdiği anlaşıldı(2,3,8,13).

Bizim deneysel sonuçlarımız;T. harzianum 1073 D3 tarafından takip edilen T. viride ATCC 32098’in maksimum laktaz aktivitesi ve laktaz özgül aktivitesine sahip olduğunu gösterdi(Fig. 1).Önceki çalışmalarda Aspergillus,Penicillium ve Fusarium kullanıldı(8,12,14-16).Ama bizim sonuçlarımız gösterdi ki bu küflerin aktiviteleri yüksek büyüme oranlarına rağmen bağıl olarak düşüktü.Literatürde, değişik enzimler için(17-19) Trichoderma sp. etkili kaynak olarak bulunmasına rağmen,T. harzianum ve T. viride’den laktaz üretiminde hiçbir çalışma bulunmadı.Bizim çalışmamızda,büyük ihtimalle enzim üretimi intraselüler olabileceği için T. harzianum 1041 D1 dışında,Trichoderma sp.’nin laktaz özgül ağırlıkları oldukça yüksek olarak belirlendi.Sonuç olarak,T. viride ATCC 32098 çalışmamızın geri kalanı için en uygun küf olarak seçildi.Bu mikroorganizma tarafından üretilen enzim ekstraselüler,bu nedenle özellikle ticari uygulamalarda bu ekonomik olarak tercih edilebilir,bu da hücreden ekstrakte edilirken neden olan masrafı ortadan kaldırır.Trichoderma sp. diğerleri arasında ksilanaz,selülaz ve laktaz üretebilir.Bu yüzden odunsu selülozik tarımsal atıkların kullanımı için,Trichoderma sp. tarafından üretilen laktaz avantajlıdır.


Figür-1eğişik küflerin laktaz aktiviteleri.Üç paralel çalışmadaki ortalama değerlerdeki sonuçlardır.Standart sapmalar grafik üzerinde gösterilmiştir.

Figür 2eğişik küflerin büyümesi. Üç paralel çalışmadaki ortalama değerlerdeki sonuçlardır.Standart sapmalar grafik üzerinde gösterilmiştir.

A.niger ve Rhizopus sp.’nin büyümesi hızlı olduğu halde,Fig. 2’den de görüldüğü gibi.aktiviteleri düşüktür.Bunun sebebi;büyüme oranları diğer küfsel kaynaklarla kıyaslandığında yüksek olduğunda bu küf karbon kaynakları olarak pepton ve mayayı laktoz kadar iyi kullanıyor olabilir.Laktazın düşük üretiminin sebebi enzim intraselüler olduğu için olabilir.

Yukarıda belirtildiği gibi Trichoderma viride ATCC 32098’in en yüksek laktaz özgül aktivitesi ve laktaz aktivitesi vardır,bu yüzden geri kalan çalışmada bunun laktaz üretimi araştırıldı.Bu noktada,bu noktada enzim aktivitesi laktoz substrat olarak kullanılarak belirlendi ve 29.54 U/ml bulundu.

Diğer taraftan,endüstriyel alanda kullanım için tasarlanan enzimde denge önemli bir kriterdir.Bu yüzden,çalışmanın ikinci kısmında,laktazın pH ve sıcaklık dengeleri araştırıldı.Bir enzimde,hem kullanım hem de depolama amacı için pH dengesi gereklidir.Mesela,değişik pH değerlerindeki çeşitli aktivitelerine rağmen,küflerden üretilen enzimler peyniraltı suyunda kullanılır,mayalardan üretilen enzimler sütte kullanılır.Ama,bizim deneysel sonuçlarımız gösteriyor ki;pH 3.0-7.5 aralığında enzim aktivitesi %90’ın üzerindeydi,bu da;üretilen enzim peyniraltı suyunda,asidik pH içerir,ve sütte,nötr pH içerir,anlamına gelir.Bulgularımıza paralel olarak,Rhizomucor ile ilgili olan bir önceki çalışmada pH 3.5-7.5 aralığında enzim aktivitesi %90’ın üzerindeydi(16).T. lanuginosus ile uygulanan bir başka çalışmada,pH 6.0-9.0 aralığında enzim aktivitesi sabitti(20).

Mikrobiyal kontaminasyonun yok edilebileceği ve yüksek reaksiyon oranının arzulandığı işlemlerde yüksek sıcaklıklarda sabit enzimler tercih edilebilir,bu nedenle endüstriyel amaçlar için kullanılan laktazların yüksek sıcaklıkta kararlı olması gerekir.Sıcaklık dengesi araştırıldığı zaman,Figür 4’ten de görülebileceği gibi enzim aktivitesi;20 derece ve 60 derece sıcaklıkları arasında %95 ve 1 saat sonra 70 derecede %66 idi.Bu sonuçlar gösteriyor ki;üretilen laktaz geniş sıcaklık aralığında değişik amaçlar için kullanılabilir.Bir önceki çalışmada bildirilmişti ki küflerden üretilen enzimler sıcaklık noktasında mayalardan üretilenlerle kıyaslandığında daha kararlıydı(8).Diğer taraftan bazı çalışmalarda,40 derecenin üstünde mayalardan üretilen laktazın aktivitesini kaybettiği,anlatıldı(12,21).




Figür-3:Laktazın pH dengesi. Üç paralel çalışmadaki ortalama değerlerdeki sonuçlardır.Standart sapmalar grafik üzerinde gösterilmiştir.


Figür-4:Laktazın sıcaklık dengesi. Üç paralel çalışmadaki ortalama değerlerdeki sonuçlardır.Standart sapmalar grafik üzerinde gösterilmiştir.

Sonuç

Şu karara varılabilir ki Trichoderma spp. Laktaz üretimi için verimli alternatiflerdir.Bu çalışmada, T. harzianum 1073 D3 tarafından takip edilen T. viride ATCC 32098’in en etkili laktaz üreticisi olduğu anlaşıldı.Buna ek olarak,üretilen laktazın hem sıcaklık hem de pH dengesi, 20 derece ve 60 derece arasında ve pH=3.0-7.5 aralığındaki çok yüksek sıcaklıktaydı;bu da şu anlama geliyor ki;endüstriyel alanda çeşitli uygulamalarda özellikle mandıra endüstrisinde bu enzim kullanılabilir.

Teşekkürler

Yukarıdaki araştırmayı kapsayan Işıl Seyis tarafından yazılan doktora tezi,Hacettepe Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından finanse edilmiştir.

Kaynaklar

1. R. R. Mahoney: Modification of Lactose and Lactose-Containing
Dairy Products with _-Galactosidase. In: Developments
in Dairy Chemistry, Elsevier, England (1985) 69–110.
2. J. Szczodrak, A. Wiater, J. Basic Microbiol. 38 (1998) 71–75.
3. Z. Nagy, T. Kiss, A. Szentirmai, S. Biro, Protein Expr. Purif.
21 (2001) 24–29.
4. D. M. Paige, L. R. Davis: Nutritional Significance of Lactose:
1. Nutritional Aspects of Lactose Digestion. In: Developments
in Dairy Chemistry, Elsevier, England (1985) 111–
132.
5. L. S. M. Daniel, D. W. Anne, R. M. Klein, Am. Fam. Physician,
65 (2002) 1845–1850.
6. L. F. Pivarnik, A. G. Senecal, A. G. Rand, Adv. Food Nutr.
Res. 38 (1995) 1–102.
7. N. Kosaric, Y. Asher, Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 32
(1985) 25–60.
8. J. Fiedurek, Z. Ilczuk, Acta Microb. Pol. 39 (1990) 37–42.
9. R. Y. Stainer, E. A. Adelberg, J. L. Ingraham: General Microbiology,
MacMillan Press Ltd., London (1980) 280–285.
10. K. Reczey, H. Stalbrand, B. Hahn-Hegerdal, F. Tijernal, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 393–397.
11. O. H. Lowry, N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, R. J. Randal, J.
Biol. Chem. 193 (1951) 265–275.
12. B. J. Macris, P. Markakis, Appl. Environ. Microb. 41 (1981)
956–958.
13. S. A. Ismail, S. S. Mabrouk, R. R. Mahoney, J. Food Biochem.
21 (1997) 145–162.
14. J. Szczodrak, Acta Biotechnol. 19 (1999) 235–250.
15. M. S. Palumbo, P. W. Smith, E. D. Strange, D. L. Van Hekken,
M. H. Tunick, V. H. Holsinger, J. Food Sci. 60 (1995)
117–119.
16. S. A. Shaikh, J. M. Khire, M. I. Khan, Biochim. Biophys. Acta,
1472 (1999) 314–322.
17. J. Gomes, I. Gomes, W. Steiner, H. Esterbauer, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 36 (1992) 701–707.
18. K. K. Y. Wong, J. N. Saddler, Crit. Rev. Biotechnol. 12 (1992)
413–435.
19. I. Seyis, N. Aksoz, Microbiologica, 26 (2003) 75–81.
20. L. Fischer, C. Scheckermann, F. Wagner, Appl. Environ. Microbiol.
61 (1995) 1497–1501.
21. S. G. Sorensen, E. V. Crisan, J. Food Sci. 39 (1974) 1184–1187.