01. Genel Bilgiler
Bu yöntem, hem toplam bakteri sayısının hem de canlı bakteri sayısının belirlenmesine uygundur. Aynı zamanda, nispeten oldukça az sayıda bakteri içeren oligotrof sular ve kaynak sularının bakteriyolojik analizi için de kullanılabilir.

Belli hacimdeki bir bakteri süspansiyonunun, alanı belli bir filitre yüzeyinden süzülmesi, bu yöntemin prensibini oluşturur. Bu mikroorganizmaların sayısı, filitre yüzeyinin doğrudan mikroskopla incelenmesiyle belirlenebileceği gibi (toplam mikroorganizma sayımı), filitrenin, uygun bir besiyeri yüzeyine konulup inkübasyonundan sonra oluşan kolonilerin sayımı ile de belirlenebilir (gelişme yeteneğinde olan canlı mikroorganizmaların sayımı).

Filitre yüzeyindeki mikroorganizmaların doğrudan sayımında, aynı Thoma lamı ile sayımda olduğu gibi, uygun sayıdaki mikroorganizma popülasyonunun filitre yüzeyine homojen bir şekilde dağılması önemlidir. Filitre edilecek sıvının miktarını, içerdiği yaklaşık mikroorganizma sayısı ve filitre büyüklüğü belirler. Direk sayım yöntemi sırasında filitre yüzeyindeki bakteri yoğunluğunun, her bir mm2 için 1.000-3.000 hücre arasında olması uygundur. Eğer filitre edilecek sıvının bakteri yoğunluğu çok daha fazla ise, materyal önce steril su ile seyreltilmelidir. Seyreltme oranına karar vermek için, aşağıda verilen yaklaşık değerler bir çıkış noktası olarak kabul edilebilir: Distrof sular (örneğin dağlarda bulunan dereler) 1 hücre/10 ml, park havuzu suyu 1.000 hücre/ml, lağım suyu 107 hücre/ml.

Uygun tarzda seyreltilen örnek, emilmek suretiyle filitre edildikten sonra, örneğin konulduğu haznenin kenarları steril su ile yıkanarak, bu suyun da filitreden süzülmesi sağlanır. Eğer örnek çok seyreltikse, yani çok az sayıda bakteri içeriyorsa, daha fazla miktarda örnek filitreden geçirilir. Su analizleri için, filitre çapı 50 mm, etkili filitrasyon alanı 12 cm2 ve gözenek büyüklüğü 0,3-0,6 ppm olan filitreler uygundur. Bu amaçla Sartorius ve Millipore firmalarının üretmiş olduğu filitreler kullanılabilir.

Filitre diskleri, kullanılmadan önce 20 dakika süre ile kaynar su içinde tutulurlar. Eğer su örnekleri, kir parçacıkları ile yoğun bir şekilde bulaşmışlarsa, kaba parçalar önceden sudan ayrılır. Örnek alındıktan analize kadar geçen süre içinde bakteri gelişimini önlemek amacıyla, örnek içine son konsantrasyonlar % 1-2 olacak şekilde formaldehit çözeltisi veya % 0,5 olacak şekilde osmiyum oksit (OSO4) ilave edilir. Bu işlem sadece toplam bakteri sayımında uygulanabilir. Filitrasyon işleminden sonra filitre, 20 dakika süre ile 50-60 °C'lık kurutma dolabında veya birkaç saat oda sıcaklığında kurutulur. Bundan sonra filitre, filitrasyon aleti üzerinde boyanır. Bunun için, filitrasyonun gerçekleştirildiği alet üzerindeki alt musluk kapanır ve üzerine 1:10 oranında seyreltilmiş alkali metilen mavisi veya Giemsa çözeltisinden damla damla verilir. Bu amaçla kullanılan boya çözeltisindeki boya parçacıklarının sayımı güçleştirmemeleri için, boya çözeltisi önceden filitre edilir. Örneğin ve boyanın özelliğine bağlı olarak 10-30 dakika sonra boya akıtılır ve destile su ile yıkanır. Boyama işlemi, kurutulmuş filitrenin boya emdirilmiş bir kaç kat kromatografi kağıdı üzerine yatırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. Boyama işlemi bittikten sonra filitre diski bu sefer destile su emdirilmiş kromatografi kağıdı üzerine yatırılır veya yine filitrasyon aleti üzerinde yıkanabilir. Buna benzer başka boyama yöntemleri de geliştirilmiştir. Boyama ve yıkama işleminden sonra filitreler kurutulup yaklaşık 5 x 10 mm boyutlarında küçük parçacıklar halinde kesilir; immersiyon yağı veya gliserin ile transparent (saydam) hale getirilir ve bir lamel üzerine konularak 800-1.000 büyütme ile mikroskopta incelenir. Sayımda her bir alandaki ortalama hücre sayısı, toplam filitre alanı ve filitrat hacminden yararlanılarak orijinal örneğin 1 ml 'sindeki toplam hücre sayısı hesaplanır.
Çizelge Selüloz ester membran filitrelerinde basit ışık mikroskobu ile yapılan direk sayımlar için diakrom boyama yöntemleri.

[size=xx-small]Boya çözeltisi ve Boyama süresi (Oda sıcaklığında) Destile su
ile yıkama
% 1 eritrosin içeren % 5'lik fenol çözeltisi 20 – 30 dakika +
% 3 eritrosin içeren % 5'lik fenol çözeltisi 12 – 24 saat (65 oC 'da 20 dakika) +
% 3 eritrosin içeren % 5'lik fenol çözeltisi 30 dakika +
% 5 eritrosin içeren % 5'lik fenol çözeltisi 2 – 3 saat +
% 0,5 eritrosin içeren % 96' lık alkol 1 – 2 dakika +
% 0,5 metilen mavisi içeren % 10'luk alkol 1 – 3 dakika -
% 0,1'lik asidik fuksin çözeltisi (suda, pH = 3,0). Bu yöntem seyreltilmiş ve % 1 pikrat ile tespit edilmiş örneklere uygulanır. 1 dakika -
% 10'luk HNO3 ile ön muamele 2 dakika % 0,1'lik asidik fuksin ile muamele 3 dakika -
% 0,02 metilen mavisi (pH = 6,5) ile muamele 2 dakika -
Fuksin ile ön boyama + % 0,01'lik viktorya mavisi (pH = 10.0) 2 – 5 dakika -[/size]

Toplam mikroorganizma sayımı yönteminde, örnek içindeki bakterilerin dispersiyonunu sağlamak amacıyla, örnek içine 10 ml % 10'luk Tween - 80 (Poly-hydroxyethylen- sorbitan- monooleat) katılabilir. Aynı su örneğinde yapılan tekerrürlü sayımlar, ortam alkali hale getirilince birbirine benzer sonuç verdiği için, su örneğinin pH'sı NaHCO3 tamponu ile 8,5 - 9,0'a ayarlanır. Diğer yandan, hücrelerin filitre yüzeyindeki dayanıklılıklarını artırabilmek amacı ile pikrik asit (% 1 + 0,85 NaCI) veya, çok hassas yapıdaki mikroorganizmaları korumak amacıyla, glutaraldehit gibi bazı fiksasyon maddelerinin kullanılması da önerilmektedir.

Basit ışık mikroskobu ile sadece, su içindeki sediment tarafından tutulmayan serbest hücreleri saymak mümkündür. Sedimente yerleşmiş bakterileri, 1 g ıslak sedimentin 25 ml filitre edilmiş 0,0004 N NaOH ile 20 dakika çalkalanarak dispersiyonundan sonra saymak mümkün olur. Benzer şekilde, 0,5 ml çamur üzerine 50-100 ml 0,005 N KOH ilavesi de mümkündür. Eğer sediment kireçlenmişte yani sertleşmişse bu, önce % 2'lik HCI ile çözülür, sonra nötralize edilir. Dispersiyon maddesi olarak Na4P2O7, (NaPO3)6 veya bunun Na2CO3 ile hazırlanmış tampon çözeltisi de kullanılabilir. Bu örnekler filitre edilmeden önce, içindeki büyük parçacıkların çökmesi amacıyla 1 -4 dakika bekletilir.

Canlı hücrelerin sayımı amacıyla materyalin oldukça yüksek oranda seyreltilmesi gerekir. Seyreltme işlemi, çapı 50 mm olan filitre yüzeyinde toplam 50 -100 hücreden fazla bulunmayacak şekilde yapılmalıdır. Materyal içinde bulunan mikroorganizmaların filitre yüzeyine homojen bir şekilde dağılmalarını sağlamak amacıyla, en az 10 - 20 ml örneğin filitreden geçirilip, filitrasyon haznesinin iç duvarlarının da bir o kadar steril tampon veya besiyeri çözeltisi ile yıkanması gerekir. Filitrasyon aletinin filitresi ile birlikte otoklavda (120 °C 'da 10 dakika) veya metal kısımlarının alevle, filitrenin de kaynatılarak sterilize edilmeleri gerekir. Filitrasyon işleminden sonra filitre, steril bir pens ile alınıp, içinde uygun bir agarlı besiyeri bulunan Petri kutusuna filitre yüzeyi üstte kalacak şekilde konur. Uygun bir inkübasyon sıcaklığı ve süresi sonucunda gelişen koloniler, bir koloni sayıcısı yardımıyla sayılır. Burada, yalnızca seçilen kültürel koşullarda gelişme yeteneğinde olan bakterilerin koloni oluşturabilecekleri açıktır. Kültürel koşulların değiştirilmesiyle anaerob veya fototrof bakterilerin de sayılmaları mümkündür.
Materyalin filitrasyonundan sonra filitrenin steril destile su ile yıkanması, bazı hallerde çok fazla miktarda suyun kullanılmasını gerektirebilir. Şöyle ki, incelenecek örneğin, suda çözünen ancak mikroorganizma gelişmesini olumlu veya olumsuz yönde etkileyecek unsurlar içermesi halinde, bu unsurların filitrasyon sırasında destile su ile yıkanarak uzaklaştırılması gerekebilir. Eğer incelenecek örnek içinde bakteri gelişmesini olumsuz yönde etkileyebilecek sodyum benzoat gibi bir antibakteriyel madde varsa, bu yöntemle sodyum benzoatın büyük oranda filitre yüzeyinden uzaklaştırılması ve dolayısıyla filitre yüzeyinde kalan bakterilerin gelişmesinin engellenmesi önlenebilir. Bunun gibi, koliform grubu mikroorganizmaların aranması sırasında, eğer örnek laktoz dışında başka bir karbohidrat içeriyorsa, koliform grubun belirlenmesinde ana prensip laktozlu besiyerindeki üremenin gözlenmesi olduğu için, filitrasyondan sonra filitre yüzeyinde herhangi bir karbon kaynağının kalmasını ve daha sonraki inkübasyon sırasında bu karbon kaynağından yararlanarak koliform dışındaki mikroorganizmaların da gelişmesini önlemek amacıyla, filitre bol su ile yıkanarak bu karbon kaynağının uzaklaştırılması gerekir.