Biyokimyasal tanı için kullanılan testlerde pozitif ve negatif kültürlerin kullanılması, olabilecek yanılmaları ortadan kaldırması nedeniyle, laboratuvarlarda yeni çalışmaya başlayanlar için ve özellikle testlerde kullanılan ayıraçların kontrol edilmesi bakımından önem taşımaktadır

GRAM BOYAMA

Kristal viyole boyası :
Kristal violet (gentian violet) 0,5 g
Distile su 100 ml

Boya distile su içinde çözüldükten sonra kaba filtre kağıdından süzülür.

İyot-Lugol çözeltisi :
Potasyum iyodür 2 g
İyot kristali 1 g
Distile su 300 ml

Potasyum iyodür distile su içerisinde iyice çözüldükten sonra iyice ezilmiş iyot kristali ilave edilir. Tam bir çözünme sağlanana kadar karıştırılır.

Safranin:
Safranin 0,5 g
Etil alkol (%95) 10 ml
Distile su 100 ml

Safranin etil alkol içinde çözündürüldükten sonra distile su ile karıştırılır.
Gram boyama seti ticari olarak hazır halde de temin edilebilmektedir.

Preparat Hazırlama:

Temiz bir lam üzerine, incelenecek mikroorganizmanın 18 – 24 saatlik taze kültüründen alınan koloni fizyolojik tuzlu su ile iyice dağıtılır. Kültür sıvı ise doğrudan lam üzerine kültürden alınarak yayılır.Preparat kuruması için tozsuz bir yerde bırakılır.

Preparat kuruduktan sonra, lamın alt yüzü 2-3 kez alevden geçirilerek mikroorganizmaların lam yüzeyine yapışması sağlanır.

Gram boyama yapmak için hazırlanmış preparatın üzerine kristal viyole boyası damlatılıp 1 dakika beklenir ve iyot-lugol çözeltisi ile yıkanarak kristal viyole uzaklaştırılır. Preparata tekrar iyot-lugol çözeltisi damlatılarak 1 - 2 dakika bekletilip, distile su ile yıkanarak iyot-lugol çözeltisi uzaklaştırılır. Preparatın üzerine %96 'lık etil alkol veya eter – aseton çözeltisi damlatılarak 10 – 15 saniye beklenir, distile su ile yıkanır ve karşıt boya olarak safranin damlatılır ve 20 - 30 saniye bekletilir. Preparat distile su ile yıkanarak havada kendi halinde kurumaya bırakılır, preparata immersiyon yağı damlatılır ve 100 'lük objektifle incelenir. Mor renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif olarak değerlendirilir.

OKSİDASE TESTİ:

Ticari olarak satılan hazır solüsyon yada stipler kullanılır. Deney 18 veya 24 saatlik taze kültürle yapılır.Mor-kırmızı renk oksidaz pozitif olarak, sarı- renksizlik negatif olarak değerlendirilir.

KATALASE TESTİ:

%3’lük H2O2
İnkübasyondan sonra besiyerinde üremiş saf kültür üzerine birkaç damla H2O2 solüsyonundan damlatılır. Kolonilerin üzerinde beyaz köpük tarzında kabarcıkların oluşumu katalaz varlığını gösterir ve test pozitif olarak değerlendirilir.

Sıvı kültürlerde katalaz testi için, üreyen kültüre birkaç damla %3’lük hidrojen peroksit damlatılır. Oksijen gazının kabarcıklar şeklinde çıkışı katalaz varlığını gösterir.

Test temizlenmiş lam üzerinde de aynı şekilde uygulanabilir.

İNDOL TESTİ:

indol besiyeri
Kovaks ayıracı: Paradimetil amino benzaldehit 5 g
Amil alkol 75 ml
Hidroklorik asit 25 ml

Amil alkol su banyosunda 60 C ’a ısıtılır, içine paradimetil amino benzaldehit ilave edilir. Erimesi bitene kadar ısıtmaya devam edilir. Erime tamamlanınca soğutulur, hidroklorik asit damla damla ilave edilir. Kovaks ayıracı altın sarısı renkte olmalıdır.Hazır olarak da temin edilir.

Testin Yapılışı: 24 saatlik sıvı kültüre 0,5 ml Kovaks ayıracı eklenerek tüp hafifçe çalkalanır. Koyu kırmızı renkli halkanın oluşumu “indol pozitif” olarak değerlendirilir. Reaksiyonu daha iyi görmek için kültüre birkaç damla eter veya ksilol eklenebilir.

ÜREASE TESTİ:

Üre besiyerinde ürenin parçalanması sonucu oluşan amonyak nedeniyle katılan reaktifin rengi kırmızıya dönüşür. Bu durum ürenin hidrolize olduğunu gösterir.

HAREKET MUAYENESİ:

Bu amaç için SİM besiyeri yada yarı katı agar besiyeri kullanılabilir. Test uygulanacak saf kültürden aseptik olarak ekim iğnesi ile alınan kültür besiyerinin ortasından dibine 5 mm kalacak şekilde ekim yapılır. Kültür 37 C ’da 24 – 48 saat inkübe edilir.Hareket pozitif kültürlerde tüpteki besiyerinin her tarafında üreme olacağından besiyeri bulanık bir hal alır. Hareket negatif kültürlerde sadece ekim çizgisi boyunca üreme görülür, ortam parlak rengini korur.

NİTRAT REDÜKSİYON TESTİ:

Nitrat redüksiyon testi uygulanacak kültür Nitrat besiyerine inoküle edilerek bir gece 37 C ’da inkübe edilir. İnkübasyon süresi sonunda besiyeri üzerine A ve B indikatörlerinden 4’er damla damlatılır. Besiyeri içindeki nitrat, bakteri tarafından nitrite indirgenmişse pembe – kırmızı bir renk oluşur.

A indikatörü : Sülfanilik asit (1 g asit 100 ml N asetik asit içinde eritilir)
B indikatörü : Dimetil alfa naftilamin (0,6 ml si 100 ml N asetik asit ile karıştırılır)

METİL RED – VOGES PROSKAUER TESTİ (MR – VP):

MRVP Besiyerine (Clark – Lups besiyerine) inoküle edilen saf suş 37 C’de 48 saat inkübasyona bırakılır.Bu kültürden 1 ml aseptik ortamda başka bir tüpe VP testinde kullanılmak üzere aktarılır.Geri kalan kültür MR testinde kullanılır.

Metil – red testi:

Metil – red kırmızısı solüsyonu;
%0,04 ’lük metil kırmızısı kullanılır (0,2 g Metil – Red kırmızısı 300 ml 95 ’lık alkol içinde eritilir). Distile su ile 500 ml’ye tamamlanır.

. İnkübasyondan sonra kültürlere ve kontrol tüpe 5 – 6 damla Metil kırmızısı solüsyonu katılır. Tüpler çalkalanır ve hemen sonuç okunur. Pozitif testlerde parlak kırmızı renk oluşur. Negatif testlerde sarı renk vardır.

Voges – Proskauer testi:

Alfa – naftol solüsyonu:
Alfa naftol 5 g
Etil alkol 100 ml
Bu solüsyon saman sarısı renginde olmalıdır.

KOH solüsyonu:
KOH 40 g
Distile su 100 ml
KOH distile suda eritilerek hazırlanır.

İnkübasyon süresi sonunda ayrılan 1ml kültür tüpüne 0,6 ml alfa – naftol solüsyonu, 0.2 ml KOH solüsyonu konarak iyice çalkalanır. Sonuç 10 – 15 dakika içinde okunur. Pozitif reaksiyonlar engeç 5 dakika içinde parlak kırmızı renk ile belirlenir. Kontrol tüplerde renk oluşmamalıdır.

SİTRAT KULLANIMI TESTİ:

Test edilecek saf kültürler Simon citrat besiyerine inoküle edilip 37 C ’da 96 saat inkübe edilir. Sitrat negatif kültürlerin inoküle edildiği besiyerinde üreme görülmezken, Sitrat pozitif kültürlerde üreme(besiyerinin maviye dönüşümü) gözlenir.

H2S DENEYİ:

TSİ Agar besiyerine inoküle edilen saf suşlar 37 C ’de 24 saat inkübasyondan sonra besiyerinde oluşan siyahlaşma ile yada SİM besiyerine inoküle edilen saf suşlar 37 C ’de 24saat inkübasyondan sonra besiyerinde oluşan siyahlaşma ile saptanabilir.

ONPG TESTİ:

ONPG(orthonitrophenil-β-D galakto pyranoside) hazır disk küçük deney tüpüne konur.Üzerine 0.1 cc fizyolojik tuzlu su eklenir.Test edilecek suş dan bir öze konur. 37 C ’da 6-24 saat inkübasyona bırakılır.Sarı renk oluşumu ONPG pozitif olarak değerlendirilir.

LİZİN DE KARBOKSİLAZ TESTİ:

TSİ besiyerindeki kültürde bu test uygulanabilir. 37 C ’da 18 saat inkübe edilen kültür üzerine 1 ml 5 N NaOH solüsyonu konur, yavaşça çalkalanır. 2 ml kloroform ilave edilerek tekrar yavaşça çalkalanır. Tüp eğik olarak yatırılarak çökme beklenir. Tüpün içindeki sıvının dip kısmındaki kloroformlu bölgeden pipetle 0,5 ml alınır, küçük bir tüpe aktarılır. Üzerine 0,5 ml ninhidrin solüsyonundan (%0,1 ’lik ninhidrin kloroformda) eklenir. 37 C ’lik etüvde bekletilir. Birkaç dakika içinde menekşe renginin oluşumu lizin de carboksilaz pozitif olarak değerlendirilir. Negatif testlerde renk değişimi olmaz.
YADA Lysine De Carboksilaz besiyeri kullanılır.

Formül :
L-Lysine monohydrochloride 0.75g
Yeast extract 0.45g
Glucose 0.15g
Bromcresol purple 0.00125g
Distle su 150ml

Tatılanhazır besiyeri içeriği distile su ile ısıtıarak çözündürlür.pH 6,8+0,2 olarak ayarlanır.5ml olarak tüplere bölünür.121 C’de 20 dak otoklav edilir.

Lizin de carboksilaz besiyerine direk test edilecek suş inoküle edilir. 37 C’de 24 saat inkubasyondan sonra renk değişimi kontrol edilir.

KARBONHİDRATLARIN FERMENTASYONU:

Glikoz, laktoz ve sukrozun fermentsyonuna yatık TSİ besiyeri ile bakılır.TSİ’ye inoküle edilen suş 37 C ’da 24 saat inkübe edilir.İnkübasyon sonunda tüpün dibindeki sarıya dönen renk değişimi glikozun kullanıldığını,yatık yüzeydeki sarıya dönen renk değişimi laktozunun kullanıldığını ,Yatık yüzeyin ucundaki sarıya dönen renk değişimi sukrozun kullanıldığını gösterir.