Konu: Protein Saflaştırma (Kromatografik Teknikler)

	: Protein Saflaştırma (Kromatografik Teknikler)
	: Pdf
	: Doç. Dr. Münir TUNCER

1. PROTEİN SAFLAŞTIRMADA TEMEL PRENSİPLER
1.1. Giriş ……………………………………………………………………………………………..… 1
1.2. Biyokimyasal Araştırmalara Genel Yaklaşım ……………………………………………….... 2
1.2.1. In Vivo Çalışmalar ……………………………………………………………………... 4
1.2.2. In Vitro Çalışmalar ……………………………………………………………………... 4
1.3. Enzimler Neden Saflaştırılmalıdır? …………………………………………………...……….. 5
1.4. Protein Saflaştırmada Temel Faktörler ………………………………………………...……... 6
1.5. Enzimlerin ve Diğer Proteinlerin Kararlılıklarının Korunması ………………………………. 6
1.5.1. Denatürasyonun Önlenmesi ………………………………………………………….. 7
1.5.2. Katalitik Bölge İnaktivasyonunun Önlemesi ………………………………………... 7
1.5.3. Proteolitik Parçalanmanın Önlenmesi ……………………………………………….. 8
1.6. Proteinlerin Özütlenmesi (Ekstraksiyonu) ….………………………………………………... 9
1.6.1. Nükleik Asitler ve Lipitlerin Uzaklaştırılması ………………………………………... 11
1.7. Ön-fraksiyonlama Prosedürleri ve Yoğunlaştırma …………………………………….......... 12
1.7.1. Çöktürme (Presipitasyon) ....……………………………………………………….…. 14
1.7.2. Ultrafiltrasyon ……………………………………………………….……………….…. 17
1.7.3. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisi ………………………..……………………….…. 19
1.7.4. Kuru Formdaki Sephadex G-25 İlavesi ………………………………………….….. 19
1.7.5. Diyaliz ve Liyofilizasyon ……………………………………………………………..… 20
1.8. Rekombinant Proteinlerin Saflaştırılması …………………………………………..…........... 20
1.8.1. İnklüzyon Cisimleri ……………………………………………………………..……… 20
1.8.2. Etiketleme ………………………………………………………………………..…….. 21
1.9. Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler …………………………………………..…..……. 23
1.10. Saflaştırma Prosedürlerinin Takibi ……………………………………………………….….. 25
2. KROMATOGRAFİNİN TEMEL PRENSİPLERİ
2.1. Giriş ……………………………………………………………………..………................... ..... 27
2.2. Dağılma Katsayısı ……………………………………………………..……….................... .... 27
2.3. Kromatografinin Mantığı ……………………………………………...………...................... .. 28
2.4. Kolon Kromatografisinin Kullanımı ………………………………...…………....................... 29
2.5. Kromatografi Terminolojisi ……………………………………………………....................... 31
2.6. Kromatografi Sistemleri ……………………………………………..…………...................... . 32
2.7. Kolon Kromatografisinin Parametreleri ……………………………..…………..................... 32
2.8. Kromatografik Sistemlerde Çözünürlük ……………………………..………….................... 34
2.8.1. Kapasite Faktörü ………………………………………………………...................... 36
2.8.2. Verimlilik ……………………………………………………..………......................... . 36
2.8.3. Seçicilik ……………………………………………………...………….................. ..... 38
2.9. Kuantifikasyon, İnternal ve Eksternal Standartlar ……………………..……….................... 39
2.10. Kromatografik Sistemlerin Seçimi …………………………………..………........................ 40
3. DÜŞÜK BASINÇ SIVI KROMATOGRAFİSİ (LPLC)
3.1. Giriş ……………………………………………………………………………..................... ..... 43
3.2. Kullanılan Kolonların Özellikleri …………………………………….…………...................... 44
3.3. Destek Materyalleri (Matriksler) ……………………………………….………...................... 45
3.4. Durgun Fazlar …………………………………………………………..……….................. .... 46
3.5. Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………............................... .. 47
3.6. Paketlenmiş Kolonun Kontrolü ………………………………………..………...................... 48
3.7. Örnek Materyalinin Hazırlanması …………………………………..…………...................... 50
3.8. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ……………………………………..…………....................... 51
3.9. Örneğin Kolondan Elüsyonu ………………………………………..…………....................... 53
3.10. Dedektörler ve Fraksiyonların Toplanması ………………………..………….................... 56
4. YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC)
4.1. Giriş ………………………………………………………………..……………................... ..... 59
4.2. HPLC’nin Avantaj ve Sınırlamaları ………………………………….…………..................... 59
4.3. HPLC Sistemleri ………………………………………………………………..................... .... 60
4.4. Matriksler ve Durgun Fazlar ………………………………………….………........................ 61
4.5. HPLC Kolonları ………………………………………………………………..................... ..... 63
4.6. HPLC Kolonun Paketlenmesi …………………………………………………....................... 66
4.7. HPLC Hareketli Fazları …………………………………………….…………....................... . 67
4.8. HPLC Pompaları ………………………………………………..…………….................... ..... 68
4.9. Örnek Hazırlama ………………………………………………..…………….................... ..... 71
4.10. Örneklerin Kolona Yüklenmesi ………………………………..……………........................ 72
4.11. Örneklerin Elüsyonu …………………………………………..……………...................... ... 74
4.12. Detektörler ……………………………………………………...……………...................... .. 76
4.12.1. Refraktif İndeks Dedektörleri ………………………..……………......................... 80
4.12.2. UV/Vis Spektrofotometrik Dedektörler …………………….………..................... 82
4.12.3. Flouresans Dedektörleri ……………………………………………....................... 87
4.12.4. Konduktivite Dedektörleri …………………………………………......................... 88
4.12.5. Elektrokimyasal Dedektörler ………………………………………........................ 88
4.13. HPLC Uygulamaları …………………………………………………………....................... .. 89
5. JEL FİLTRASYON KROMATOGRAFİSİ (GFC)
5.1. Giriş ……………………………………………………………..…….……...…................ ........ 91
5.2. GFC’nin Temel Prensipleri .......……………………………….…….…………....................... 91
5.3. Matriksler …………………………………………………….……….………...................... .... 93
5.4. Deneysel Parametreler …………………………………………..…….………..................... .. 93
5.5. Moleküllerin Davranış Özellikleri …………………………….…….…………........................ 95
5.6. Deneysel Koşulların Dizaynı ………………………………………….………........................ 98
5.6.1. Performans ………………………………………………….…………..................... .. 98
5.6.2. Matriks Seçimi …………………………………………...….………….................... ... 100
5.6.2.1. Deneyin Amacı …………………………………..…………......................... 100
5.6.2.2. Ayrıştırılacak Olan Moleküllerin Özellikleri …........................................... 102
5.6.2.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 103
5.6.3. Kromatografi Koşullarının Seçimi ……………………………………...................... 103
5.6.3.1. Kolon Seçimi ………………………………………………........................... 103
5.6.3.2. Akış Oranı ………………………………………………….......................... . 105
5.6.3.3. Örnek Materyalinin Özellikleri …………………………….......................... 105
5.6.3.4. Hareketli Faz ……………………………………...………......................... ... 108
5.6.3.5. Optimizasyon ……………………………………………….......................... 108
5.7. Jel Filtrasyon Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………….…………..................... 109
5.7.1. Jelin Hazırlanması ……………………………………….……………...................... 109
5.7.2. Kolonun Paketlenmesi ve Dengelenmesi ………………….………….................... 111
5.7.3. Örneğin Kolona Yüklenmesi ……………………………….…………...................... 111
5.7.4. Elüsyon …………………………………………………….………….................... ..... 111
5.7.5. Kolonun Temizlenmesi ………………………………….……………....................... 111
5.7.6. Kolonun ve Jellerin Korunması ………………………….……………..................... 113
5.8. GFC Uygulama Örnekleri ……………………………………………………………............... 114
6. İYON DEĞİŞ-TOKUŞ KROMATOGRAFİSİ (IEC)
6.1. Giriş ………………………………………………………………….………….................... ..... 117
6.2. İyon Değiş-tokuş Kromatografisinin Teorisi ……………………….…………...................... 117
6.3. İyon-değiştirici Matriksler ………………………………………….…………........................ . 119
6.4. Fonksiyonel Yüklü Gruplar ……………………………………….……………...................... 120
6.5. Kapasite ………………………………………………………………………....................... ... 121
6.6. Deneysel Koşulların Dizaynı …………………………………………...………..................... 122
6.6.1. İyon-değiştiricinin Seçimi ……………………………………...………..................... 122
6.6.1.1. Ayrıştırma İşleminin Özgül Gereksinimleri ……….………....................... 122
6.6.1.2. Örnek Bileşiklerinin Moleküler Büyüklükleri ………………....................... 124
6.6.1.3. Örnek Bileşiklerinin Kararlılığı ve İzoelektrik Noktaları ……..................... 124
6.6.2. Başlangıç Koşullarının Dizaynı ………………………………….............................. 125
6.6.2.1. Başlangıç pH’sının Seçilmesi …………………………………................... 125
6.6.2.2. Kuvvetli veya Zayıf İyon-değiştiricinin Seçimi ……………….................... 129
6.6.2.3. Tampon Seçimi …………………………………….…………...................... 130
6.7. İyon Değiş-Tokuş Kromatografisinin Gerçekleştirilmesi ……………………….................... 133
6.7.1. Kolon Seçimi ve Dizaynı ………………………………………………..................... 133

:

lütfen bu dosyayı indirmek istiyorum ama dosya yüklediğim halde kredi diyor nasıl indirebilirm bu konuda yardımcı olursanız sevinirim.....