SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEM İLE KAFEİN TAYİNİ

Gerekli Olan Malzemeler: Huni - Erlen - Cam Pamuk - 10ml'lik Pipet - Ayırma Hunisi - Amonyak - Kloroform - 50ml'lik ve 100 ml’lik, Balon Joje - Spektrofotometre.

• Su ekstraktı tayini yapılır. Süzüntüden pipet yardımıyla 10 ml alınarak ayırma hunisine konulur. Üzerine pipetle 0.5ml amonyak ilave edilerek hafifçe elde çalkalanır.
• Tekrar bu karışıma pipet vasıtasıyla 10 ml kloroform ilave edilir ve elde 1-2 dakika daha çalkalanır (Çalkalama işlemi sonucunda kloroformun ayırma hunisinin alt kısmına çöktüğü görülecektir).
• Daha sonra 50 ml’lik balon jojenin üzerine huni ile birlikte cam pamuk yerleştirilir. Ayırma hunisinin alt kısmında kalan kloroform cam pamuktan süzülerek bu balon joje içerisine akıtılır. (Sadece alt kısımdaki kloroformun akıtılmasına dikkat edilmelidir.)
• Tekrar ayırma hunisine pipetle 10 ml kloroform konularak 1-2 dakika hafifçe çalkalanır. Ayırma hunisinin alt kısmında kalan kloroform yine cam pamuktan süzülerek balon jojeye aktarılır.
• Balon joje kloroform ile 50 ml’ ye tamamlanır. Bu balon jojeden alınan numune ile 276 nm dalga boyunda spektrofotometrede ölçüm yapılır.

% Kafein : [ Absorbans x Kurve Faktörü x 0,125 (seyrelme faktörü) ] / [(100-Rutubet) / 100]

Kafein Standardı Hazırlama Yöntemi:

Stok kafein çözeltisi : Rutubeti alınmış 0,1 gr kafein tartılır ve kloroform ile 100 ml’ye tamamlanır. Hazırlanan stok çözeltinin konsantras- yonu 1000 ppm dir.

Ara stok kafein çözeltisi : Stok Kafein çözeltisinden 10 ml alınır.ve 100 ml kloroform ile tamamlanır.Hazırlanan bu ara stok 100 ppm kafein içeriyor demektir.

Standart Kafein Çözeltisi : Hazırlanan ara stoktan 2 ml- 4 ml –6 ml – 8ml – 10 ml alınarak 50 ml’lik balonlara aktarılır ve balonlar işaret çizgilerine kadar kloroform ile tamamlanır.Hazırlanan bu standartlar sırasıyla 4ppm, 8ppm,12ppm,16ppm, 20ppm kafein içerirler.Her standardın 276 nm dalga boyunda spektrofotometrede kloroforma karşı absorbansı belirlenir. Buradan kurve faktörü hesaplanır.

Kurve Faktörü : (Konsantrasyon / Absorbans) / Konsantrasyon Sayısı
Kurve Faktörü : ( 4 / Abs + 8 / Abs + 12 / Abs + 16 / Abs + 20 / Abs) / 5